張 蕓，倪德江，余 志，謝筆鈞*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北經(jīng)濟(jì)學(xué)院旅游與酒店管理學(xué)院，湖北 武漢 430205；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430070）

茶多糖（tea polysaccharides，TPS）是茶葉中的主要活性成分之一，具有降血糖、降血脂及增強(qiáng)免疫等多種活性，對(duì)其提取純化、活性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了廣泛的研究[1-7]。TPS通常采用水提醇沉法[8]提取粗品，在此過(guò)程中，部分有色物質(zhì)和蛋白質(zhì)會(huì)隨多糖一并沉淀下來(lái)，使得到的TPS粗品呈褐色并含有一定量的蛋白質(zhì)，從而影響TPS的純度，干擾TPS的定量[9]、結(jié)構(gòu)鑒定與活性研究，因此需要對(duì)其進(jìn)行脫色脫蛋白處理。TPS多采用H2O2氧化脫色[10-11]，但這樣容易使多糖氧化分解，從而破壞多糖的結(jié)構(gòu)，并可能破壞多糖的活性，且存在安全性問(wèn)題；脫蛋白常采用Sevag法[12-13]，但是效率不高，操作繁瑣，且需要使用大量的有機(jī)溶劑[14-15]，這不僅污染環(huán)境，而且有機(jī)溶劑的殘留也會(huì)帶來(lái)安全性問(wèn)題。TPS的脫色脫蛋白方法目前有少量研究，但多集中在綠茶多糖[15-18]，而烏龍茶因在加工過(guò)程中需進(jìn)行半發(fā)酵，部分多酚氧化成為有色的多酚氧化物，使得烏龍茶多糖（oolong tea polysaccharides，OTPS）顏色更深，脫色難度更大，其脫色脫蛋白方法的對(duì)比研究還鮮有報(bào)道。聚酰胺是由酰胺聚合而成的一類高分子化合物，對(duì)酚類等富含酚羥基的化合物具有較強(qiáng)的吸附性[19-20]，也能吸附蛋白質(zhì)，因此對(duì)TPS具有同時(shí)脫色和脫蛋白的效果[18]。為此，本研究著重研究了OTPS聚酰胺柱層析的洗脫條件，建立了OTPS聚酰胺脫色脫蛋白的工藝，并與Sevag-H2O2聯(lián)用法對(duì)比，比較其脫色、脫蛋白效果及純化后產(chǎn)品的抗氧化活性，聚酰胺柱層析法是一種目前理想的OTPS脫色脫蛋白的方法，可為OTPS的純化技術(shù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茶樹品種為大葉烏龍，夏季按一芽三四葉的標(biāo)準(zhǔn)采于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹茶葉研究所。

聚酰胺（粒徑：50～160 μm；容重0.25 g/mL） 瑞士Fluka公司；SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

MODEL-3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮科學(xué)儀器廠；LD5-10型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；ALPHAL-2凍干機(jī) 德國(guó)Matin Christ公司；D100B恒流泵、BSZ-160分部收集器 上海青浦滬西儀器廠；HD-21-1型核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)器 上海嘉鵬科技有限公司；LM-17型記錄儀永清示波器廠；722型分光光度計(jì) 上海實(shí)驗(yàn)科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 烏龍茶制作工藝及OTPS制備

鮮葉原料→曬青→攤放→搖青→靜置→二次搖青→靜置→三次搖青→靜置→殺青→揉捻→干燥

烏龍茶經(jīng)過(guò)水提醇沉、凍干后得OTPS。OTPS中中性糖含量為26.72%、糖醛酸含量為18.98%、蛋白質(zhì)含量為7.34%、茶多酚含量為4.23%。

1.3.2 OTPS聚酰胺柱層析洗脫條件的研究

稱取一定質(zhì)量的OTPS，用去離子水配成質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，離心去除不溶物后作為OTPS原液備用。

選用Ф 20 mm×150 mm的層析柱，填入20 mL處理好的聚酰胺，3倍柱體積去離子水平衡后，上樣，吸附平衡，去離子水洗脫，收集含糖管。以脫色率、脫蛋白率和總糖保留率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，從上樣量、上樣體積、吸附平衡時(shí)間以及洗脫速率4個(gè)方面確定聚酰胺柱層析的洗脫條件。

1.3.2.1 最佳上樣量的確定

取5份OTPS原液，通過(guò)稀釋使多糖溶液的上樣量分別為20、40、60、80、100 mg，上樣體積為10 mL，吸附平衡30 min，3 mL/min速率洗脫。

1.3.2.2 最佳上樣體積的確定

取3份OTPS原液，上樣量為80 mg，通過(guò)稀釋使多糖的上樣體積分別為8、10、12 mL，吸附平衡30 min，3 mL/min速率洗脫。

1.3.2.3 最佳吸附平衡時(shí)間的確定

取5份OTPS原液，上樣量為80 mg，上樣體積為10 mL，分別吸附平衡5、10、20、30、60 min，3 mL/min速率洗脫。

1.3.2.4 最佳洗脫速率的確定

取5份OTPS原液，上樣量為80 mg，上樣體積為10 mL，吸附平衡30 min，分別以1.5、3、4.5、6、9 mL/min的速率洗脫。

式中：下標(biāo)1為上樣液，2為收集液；V為溶液體積；M為總糖質(zhì)量，采用苯酚-硫酸法[21]測(cè)定。

1.3.3 OTPS不同脫色脫蛋白方法的比較

稱取一定量的OTPS，用去離子水配成質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，離心去除不溶物后作為OTPS原液，記作Y。取一定量OTPS原液分別采用聚酰胺柱層析法、Sevag法、H2O2法及Sevag-H2O2聯(lián)用法處理，所得產(chǎn)品分別記作P、S、H及SH。測(cè)定各個(gè)產(chǎn)品的色度和中性糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)、茶多酚含量，計(jì)算脫色率、脫蛋白率和總糖（中性糖和糖醛酸總和）保留率。將原液和各方法處理后的產(chǎn)品冷凍干燥后，計(jì)算得率，并測(cè)定抗氧化活性。

1）聚酰胺柱層析法：取處理好的聚酰胺200 mL，裝入Ф 36 mm×300 mm的層析柱中，3倍柱體積去離子水平衡后，加入10 mg/mL OTPS原液80 mL，吸附平衡20 min，以3 mL/min的流速用去離子水洗脫，收集含糖管。2）Sevag法：80 mL OTPS原液中加入1/5 體積的氯仿和1/25 體積的正丁醇，劇烈振搖20 min，離心，棄去蛋白質(zhì)和氯仿層，重復(fù)處理8次，透析（自來(lái)水48 h，蒸餾水24 h）[22]。3）H2O2法：80 mL OTPS原液或Sevag法脫蛋白后的多糖溶液用氨水調(diào)pH 8.0左右，50℃條件下加入體積分?jǐn)?shù)30%的H2O280 mL，保溫2 h，用HCl溶液調(diào)至中性，透析（自來(lái)水48 h，蒸餾水24 h）[22]。

色度：以450 nm波長(zhǎng)處吸光度表示[18]；中性糖含量：硫酸-蒽酮比色法[23]；糖醛酸含量：硫酸-咔唑法[24]；蛋白質(zhì)含量：考馬斯亮藍(lán)G-250法[23]；茶多酚含量：酒石酸亞鐵比色法[23]；對(duì)羥自由基的清除率：將TPS溶液配成5 mg/mL質(zhì)量濃度，采用D-脫氧核糖-Fe體系法評(píng)價(jià)[22]；對(duì)超氧陰離子自由基的清除率：將TPS溶液配成1 mg/mL質(zhì)量濃度，采用黃嘌呤氧化酶法評(píng)價(jià)[25]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 OTPS聚酰胺柱層析洗脫條件的研究

2.1.1 上樣量的影響

圖1 上樣量對(duì)OTPS脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的影響Fig.1 Effect of OTPS concentration on the decoloration rate,deproteinization rate and polysaccharide retention rate

由圖1可知，當(dāng)上樣體積為10 mL，吸附平衡30 min，3 mL/min速率洗脫時(shí)，隨著上樣量的增加，脫色率和脫蛋白率下降，總糖保留率增加。綜合考慮脫色率、脫蛋白率、總糖保留率，以及聚酰胺柱層析的處理量，相對(duì)20 mL聚酰胺，選擇80 mg OTPS的上樣量，即4 mg OTPS/mL聚酰胺。

2.1.2 上樣體積的影響

當(dāng)OTPS上樣量一定時(shí)，上樣體積過(guò)小，會(huì)導(dǎo)致溶液濃度過(guò)高，溶解度低且黏度大，流動(dòng)性差；上樣體積過(guò)大，則會(huì)導(dǎo)致直接泄漏。因此當(dāng)聚酰胺用量為20 mL，上樣量為80 mg時(shí)，僅比較了8、10、12 mL 3個(gè)上樣體積時(shí)OTPS的脫色率、脫蛋白率和總糖保留率。由圖2可知，隨著上樣體積的增加，脫色率和脫蛋白率下降，總糖保留率增加，但總糖保留率的增加幅度相比脫色率和脫蛋白率的降低幅度要小。同時(shí)，上樣體積越小，含糖管相對(duì)更集中，拖尾少。因此，選擇8 mL的上樣體積，即2/5倍的聚酰胺柱體積。

圖2 上樣體積對(duì)OTPS脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的影響Fig.2 Effect of OTPS volume on the decoloration rate, deproteinization rate and polysaccharide retention rate

2.1.3 吸附平衡時(shí)間的影響

圖3 吸附平衡時(shí)間對(duì)OTPS脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的影響Fig.3 Effect of adsorption equilibrium time on the decoloration rate,deproteinization rate and polysaccharide retention rate

由圖3可知，吸附平衡20 min以內(nèi)時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，脫色率和脫蛋白率上升，總糖保留率下降；但超過(guò)20 min后，脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的變化都不大。因此，選擇上樣后吸附平衡20 min。

2.1.4 洗脫速率的影響

圖4 洗脫速率對(duì)OTPS脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的影響Fig.4 Effect of elution velocity on the decoloration rate,deproteinization rate and polysaccharide retention rate

由圖4可知，隨著洗脫速率的增加，脫色率和脫蛋白率下降，總糖保留率增加。綜合考慮脫色率、脫蛋白率和總糖保留率的大小和變化幅度，以及洗脫效率，選擇以3 mL/min的速率洗脫。

2.2 OTPS不同脫色脫蛋白方法的比較

表1 OTPS不同脫色脫蛋白方法的效果Table1 Comparison of decoloration and deproteinization methods for OTPS%

由表1可以看出，聚酰胺柱層析法的脫色率顯著高于H2O2脫色法，脫蛋白率和Sevag法沒(méi)有顯著性差異。與傳統(tǒng)的Sevag-H2O2聯(lián)用法相比，聚酰胺柱層析法的脫色率和脫蛋白率都要略低一些，這是因?yàn)镠2O2在脫色的同時(shí)可以脫除一定量的蛋白質(zhì)，Sevag法在脫蛋白的同時(shí)也有一定的脫色效果。聚酰胺柱層析法的總糖保留率和產(chǎn)品得率要顯著高于Sevag-H2O2聯(lián)用法，這可能是由于部分蛋白質(zhì)與茶多糖綴合在一起，采用Sevag法脫蛋白會(huì)脫去這部分糖蛋白綴合物，而多糖脫蛋白的目的并非要徹底的除去蛋白，而是脫除游離蛋白質(zhì)。另外，聚酰胺柱層析法和Sevag-H2O2聯(lián)用法均能將OTPS中的茶多酚含量由4.12%降到1%以下，也能同時(shí)起到除去OTPS粗品中其他雜質(zhì)的作用。從環(huán)境保護(hù)和安全的角度考慮，無(wú)論是傳統(tǒng)的Sevag-H2O2聯(lián)用法，還是單獨(dú)的Sevag法和H2O2法，都會(huì)帶來(lái)不同程度的環(huán)境污染和安全性問(wèn)題，而聚酰胺柱層析法則是符合綠色提取工藝，同時(shí)也保證了安全性。

表2 脫色脫蛋白前后OTPS對(duì)羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率Table2 Scavenging capacity of crude and purified OTPS on hydroxyl radical and superoxide anion radical%

由表2可以看出，聚酰胺柱層析法和Sevag-H2O2聯(lián)用法脫色脫蛋白后產(chǎn)品對(duì)羥自由基的清除率顯著低于未脫色脫蛋白之前的OTPS，但降低幅度不大，且這兩種方法所得產(chǎn)品之間無(wú)顯著性差異；聚酰胺柱層析法脫色脫蛋白后產(chǎn)品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率顯著高于未脫色脫蛋白之前的OTPS，而Sevag法、H2O2法及Sevag-H2O2聯(lián)用法脫色脫蛋白后產(chǎn)品對(duì)超氧陰離子自由基的清除率均顯著低于未脫色脫蛋白之前的OTPS，這說(shuō)明Sevag法和H2O2法均會(huì)破壞茶多糖的抗氧化活性。

3 結(jié) 論

選擇合適的脫色脫蛋白方法對(duì)多糖的研究至關(guān)重要。本研究對(duì)OTPS聚酰胺柱層析條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了聚酰胺層析的最佳條件為：4 mg OTPS/mL聚酰胺，2/5倍柱體積去離子水溶解上樣，吸附平衡20 min，3 mL/min速率洗脫。

在此基礎(chǔ)上，將聚酰胺柱層析法和傳統(tǒng)的Sevag-H2O2聯(lián)用法對(duì)OTPS脫色脫蛋白，綜合對(duì)比脫色率、脫蛋白率、總糖保留率、產(chǎn)品得率和抗氧化效果，表明聚酰胺柱層析法脫色率、脫蛋白率雖略低于Sevag-H2O2聯(lián)用法，但總糖保留率和產(chǎn)品得率高，尤其是能很好地保留并提高OTPS的抗氧化活性，是一種較好的OTPS脫色脫蛋白方法，而且也是符合綠色化學(xué)提取要求的。

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