王曉琴，李方友，高旭峰，鄭秀芳，金有銀，盧雅蘭，張芬琴*

（河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院，甘肅 張掖 734000）

黃參是傘形科迷果芹（Sphallerocarpus gracilis）的肉質(zhì)根莖，俗稱野胡蘿卜，黃參富含蛋白質(zhì)、黃酮、多糖和類胡蘿卜素及人體必需的多種氨基酸和豐富的礦質(zhì)元素[1-2]；黃參是一種藥食兼用的極具開發(fā)前景的特色野生植物資源，不僅有獨特的風味和營養(yǎng)，而且還有一定的保健和療效作用[3-7]。胡蘿卜具有“小人參”之美稱，通常為一年生，傘形科草本植物[8]。胡蘿卜營養(yǎng)價值很高，來源廣泛且價格低廉，含有豐富的β-胡蘿卜素（即VA原）、鋅、鐵、鈣等元素和膳食纖維[9]。胡蘿卜具有許多功效，如益肝明目、通便、防癌、降壓降脂和增加人體免疫力等[10-12]。它是一種對人體健康非常有益的食品[9]。

凝固型酸乳以口感好、酸甜可口、營養(yǎng)豐富被廣大消費者認可。近年來，研究者們將一些功能性配料添入凝固型酸乳中，開發(fā)出營養(yǎng)價值更高的新型酸乳。如權美平[13]研發(fā)了添加杏仁等的酸乳，陶偉雙等[14]研發(fā)了添加銀耳的酸乳，陳默等[15]研發(fā)了添加山藥的酸乳，王蔚新等[16]研發(fā)了添加大豆的凝固型酸乳。這些添加物不僅拓寬了酸乳的花色品種，而且增強了傳統(tǒng)酸乳的營養(yǎng)，具有很好的保健作用。

本實驗以黃參和胡蘿卜為材料，采用Plackett-Burman試驗、最陡爬坡試驗、Box-Behnke試驗設計對黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳工藝參數(shù)進行優(yōu)化；對影響酸乳口感的關鍵因素進行了研究，從而確定酸乳的原料要求，既能節(jié)約生產(chǎn)成本，又不影響酸乳口感；促進黃參和胡蘿卜復合功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，此產(chǎn)品不僅豐富了市場酸乳制品的花色，并且為胡蘿卜和黃參的發(fā)展提供了新的途徑；為河西地區(qū)乳品企業(yè)產(chǎn)品創(chuàng)新、拓寬酸乳的品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃參采樣于甘肅山丹縣；永昌胡蘿卜選用新鮮、勻稱、顏色鮮亮、肉厚、飽滿、無蟲蛀、無明顯溝痕和分叉的新鮮胡蘿卜；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb.）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St.）混合菌種（1∶1）由河西學院農(nóng)業(yè)與生物技術學院微生物實驗室經(jīng)試驗篩選、培養(yǎng)馴化而得；鮮牛乳 甘肅省張掖市鑫源乳業(yè)公司；蔗糖、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）、黃原膠均為食品級。

1.2 儀器與設備

TGL-220型冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；CL-30L全自動高壓滅菌鍋 日本ALP公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；PHS-2F數(shù)字pH計 上海雷磁儀器廠；A-260蓋勃氏乳脂計 滄州高密分析儀器廠；AE200電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MJX-160恒溫培養(yǎng)箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司；SW-CJ-ID超凈化工作臺 蘇州凈化設備廠；SMART光學顯微鏡 北京泰克儀器有限公司；SY-6型榨汁機 九陽股份有限公司；OSU-4L脈沖電場殺菌設備 美國俄亥俄州立大學。

1.3 方法

1.3.1 Plackett-Burman試驗設計

表1 Plackett-Burman試驗設計因素水平Table1 Factors and levels used for Plackett-Burman design

采用Plackett-Burman兩水平法對影響黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳發(fā)酵的8個因素進行考察，每個因子取高（1）和低（－1）2個水平，響應值為沉淀率（Y）。篩選影響黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率的主效因素，試驗因素水平及編碼見表1。

1.3.2 最陡爬坡試驗

響應面擬合方程只有在考察的鄰近區(qū)域里才能充分近似真實情況，所以先逼近最大沉淀率區(qū)域后才能建立有效的擬合方程。根據(jù)Plackett-Burman試驗篩選出顯著因子，進行最陡爬坡試驗，以期尋找到沉淀率。

1.3.3 響應面試驗設計

根據(jù)Box-Behnken設計原理[17-18]，對Plackett-Burman試驗確定的主效因和最陡爬坡試驗確定的因素水平的中心點，取三水平作相互作用，確定最優(yōu)組合，試驗因素水平及編碼見表2。

表2 Box-Behnken試驗因素水平及編碼表Table2 Codes and levels of factors used for Box-Behnken design

1.3.4 工藝流程

胡蘿卜→清洗→切片→護色→榨汁→過濾→胡蘿卜汁 黃參漿←過濾無菌灌裝←打漿←去皮←滅菌←選料←黃參

鮮牛奶→預熱→加糖→混合調(diào)料（胡蘿卜汁、黃參漿）→滅菌（90℃、5 min）→冷卻→接種（加入發(fā)酵劑←擴大←活化←菌種）→無菌灌裝（殺菌后無菌灌裝至已滅菌的玻璃瓶內(nèi)）→保溫發(fā)酵→冷卻后酵（24 h）→成品→檢驗

1.3.5 胡蘿卜汁的制備

選取新鮮、勻稱、顏色鮮亮、無蟲蛀、無明顯溝痕和分叉的新鮮胡蘿卜，用流水沖洗去除泥土等雜質(zhì)，用質(zhì)量分數(shù)2%氫氧化鈉溶液（90℃）浸泡1～2 min[19]，后置于流動清水中清洗，用pH值試紙測試呈中性為止。將胡蘿卜切分成0.5～1 cm厚的薄片，按料液比1∶3（m/V）護色（用質(zhì)量分數(shù)0.03%抗壞血酸），漂燙5 min，待降溫至60～70℃榨汁。將榨出的汁液用8 層無菌脫脂紗布過濾2次，在4 000 r/min條件下離心15 min，分離漿液后，取上清液，冷藏備用。

1.3.6 黃參漿的制備

參照文獻[20]選取無明顯溝痕、完整干凈的新鮮黃參，快速用流水沖洗干凈。在相對于黃參體積10倍的蒸餾水中將質(zhì)量分數(shù)3%的白砂糖溶解，再將黃參浸入其中，用封口膜封好；85℃高壓蒸煮，20 min后去皮榨漿備用。

1.3.7 發(fā)酵劑的制備

以體積分數(shù)3%～4%的比例將保存的液體菌種接入滅菌乳中，42℃培養(yǎng)12～24 h，冷卻后置于4℃冰箱中保存。傳代3次，菌種可達正?；盍?，制得母發(fā)酵劑，冷藏備用。

1.3.8 菌種馴化

將活化后的混合菌種接種于胡蘿卜汁和黃參漿1∶2（m/m）再加鮮牛奶的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度39℃、培養(yǎng)時間6 h逐步馴化（三代）后，穩(wěn)定提高菌種活力，繁殖速度加快，即進行擴大培養(yǎng)。

1.3.9 黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳的工藝操作要點

1.3.9.1 預熱、調(diào)配、滅菌及接種

將檢驗合格的原料乳預熱至60℃時加入6%～8%的白砂糖，加熱至90～95℃，保溫5 min。降溫至70℃，攪拌后加入黃參漿和胡蘿卜汁，再攪拌，繼續(xù)加熱至70℃后保持2 min；降溫至45℃，在無菌條件下，將發(fā)酵劑充分攪勻按接種量為3%～5%加到混合乳中，攪拌5 min均勻，灌裝發(fā)酵。

1.3.9.2 保溫發(fā)酵及冷藏

在43℃條件下進行保溫發(fā)酵，待完全凝乳后停止發(fā)酵，將發(fā)酵后的產(chǎn)品迅速冷卻至10℃以下，然后置于0～4℃的環(huán)境中后發(fā)酵24 h，經(jīng)檢驗合格后即為成品。

1.3.10 測定方法

乳酸菌計數(shù)：按GB/T 4789.35—2010《食品衛(wèi)生微生物學檢驗：食品中乳酸菌檢驗》規(guī)定的方法檢驗[21]。

總固形物、酸度、脂肪：按GB/T 5413.39—2010《乳與乳制品衛(wèi)生標準的分析方法》規(guī)定的方法檢驗[22]；蛋白質(zhì)：按GB/T 5009.52—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》規(guī)定的方法檢驗[23]。

持水力：取5 mL的樣品離心后除去上清液，使離心管保持倒置狀態(tài)10 min。結束后立即稱量[24]。計算公式如下：

沉淀率的測定[25]：準確稱取樣液5 mL于離心管中，3 000 r/ min離心10 min，去除上清液，準確稱取沉淀質(zhì)量，計算沉淀率，公式如下：

1.3.11 微生物指標檢測

大腸菌群和致病菌：按GB/T 19302—2010《食品衛(wèi)生微生物學檢測：乳與乳制品檢驗》規(guī)定的方法檢驗[26]。

2 結果與分析

2.1 影響黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳發(fā)酵重要影響因素的篩選

Plackett-Burman試驗設計及結果見表3。利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對Plackett-Burman試驗結果進行方差分析，各因素的影響效果見表3，由表3可見，x5（黃參漿添加量）、x2（胡蘿卜汁添加量）、x6（加糖量）和x7（發(fā)酵劑添加量）對沉淀率的影響最為顯著，而且4個因素的效應值為正，而其他因素對沉淀率影響較小，故在下一步響應面分析中只考察4個因素最優(yōu)水平。

表3 Plackett-Burman試驗設計及結果Table3 Design and results of Plackett-Burman experiments

2.2 最陡爬坡試驗確定因素水平

表4 Plackett-Burman試驗參數(shù)估計表Table4 Coefficient estimates of PB design

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table5 Results of steepest ascent design%

由表4關鍵因素效應可以看出，要使黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳穩(wěn)定、感官質(zhì)量好、沉淀率最佳[27-28]，應該提高黃參漿添加量、胡蘿卜汁添加量、加糖量和接種量，沉淀率可以快速、準確地判斷所添加穩(wěn)定劑的含量在含乳飲料體系中應用的可行性，為生產(chǎn)和科研提供理論依據(jù)[29]。根據(jù)上述4個關鍵因素效應的大小比例設定它們的變化方向及步長進行的試驗設計及結果見表5，隨著4個重要因素的不同變化，沉淀率的變化趨勢是先上升后下降，其中在3號水平上達到最大值，由此可知，最佳沉淀率分在3號水平附近，選此水平為中心點作為后續(xù)的響應面設計。

2.3 Box-Behnken試驗設計及結果

取爬坡試驗表5中的3號試驗條件作為響應面試驗因素水平的中心點進行響應面試驗設計。以四因素三水平進行響應面試驗，Box-Behnken試驗設計及結果見表6。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table6 Design and results of Box-Behnken experiments

Box-Behnken試驗設計中對試驗結果進行擬合的二次模型方差分析見表7，回歸方程中各變量對響應值影響的顯著性由P值來判定，概率P值越小，則相應變量的顯著性越高[30]。利用軟件Design-Expert 8.0.5.0對表中的試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到編碼空間二次函數(shù)模型為：Y=44.49+0.052A－2.89B－1.96C+0.32D－0.38AB－2.74AC－3.04BC－9.89A2－12.10B2－8.88C2－9.06D2，方差分析及F檢驗結果列于表8。

表7 Box-Behnken試驗方差分析及顯著性檢驗Table7 Significance test and variance analysis of Box-Behnken experiments

表8 回歸模型系數(shù)顯著性檢驗Table8 Significance test for each item in the regression model

多元回歸模型擬合度采用R2表示，以R2＞0.9判定為優(yōu)[31]。軟件分析的多元擬合系數(shù)為R2=0.986 6，說明模型對試驗實際情況擬合較好；預測R2=0.929 9，模型的校正決定系數(shù)R2=0.973 2，說明該模型能解釋97.32%響應值的變化；由表7可知，本模型擬合程度明顯，其F值為73.74，P值小于0.000 1，說明模型極顯著；可用來進行響應值預測。根據(jù)模型失擬項P值為0.165 5＞0.05，不顯著，說明模型中不需要引入更高次數(shù)的項，模型選擇合適。所以，可以使用該模型來分析響應值的變化。從表8還可以看出因素一次項（A、B、C、D）、二次項（A2、B2、C2、D2）對結果影響是極顯著的，交互項AC、AD、BC、BD對結果影響也極顯著。

2.4 響應面互作效應分析與優(yōu)化

從Box-Behnken試驗方差分析的顯著性檢驗可以看出，黃參漿添加量（A）和發(fā)酵劑添加量（D）的互作效應對黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率影響明顯（P＜0.05），通過Design-Expert 8.0.5.0軟件作其響應面曲線圖。圖1分別為4組以黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率為響應值的趨勢圖，可以更直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度。

由圖1可以看出，響應值存在最大值，通過軟件分析計算，得到黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳預測值最大時的工藝參數(shù)為黃參漿添加量4.98%、胡蘿卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、發(fā)酵劑添加量4.05%，此條件下發(fā)酵3.5 h，預測值為44.83%?？紤]到實際配制的方便，將各因素條件修正為黃參漿添加量5%、胡蘿卜汁添加量10%、加糖量7%、發(fā)酵劑添加量4%，在此條件下發(fā)酵3.5 h。黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳穩(wěn)定性最好，在修正條件下對試驗結果進行3次重復驗證實驗，黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率為45.29%。與理論預測值吻合得很好，表明模型合理有效。

2.5 酸乳品質(zhì)檢測結果

表9 理化指標Table9 Physical and chemical propertiess of yoghourt

表10 微生物指標Table10 Microbiological indexes of yoghourt

3 結 論

3.1 通過Plackett-Burman設計、最陡爬坡試驗對影響黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率及工藝條件進行篩選，發(fā)現(xiàn)對黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率影響顯著的因素有黃參漿添加量、胡蘿卜汁添加量、發(fā)酵劑添加量和加糖量，而其他因素在試驗設定的范圍內(nèi)影響不顯著。

3.2 通過對擬合二次回歸模型方差分析，發(fā)現(xiàn)黃參漿添加量和加糖量、黃參漿添加量和發(fā)酵劑添加量、胡蘿卜添加量和加糖量、胡蘿卜添加量和發(fā)酵劑添加量的互作效應對黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率影響明顯。

3.3 通過Box-Behnken試驗設計及響應面分析獲得的最佳工藝參數(shù)為黃參漿添加量4.98%、胡蘿卜汁添加量9.72%、加糖量7.13%、發(fā)酵劑添加量4.05%，在此條件下發(fā)酵3.5 h，黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳沉淀率為 44.83%。實測值為45.29%，與理論預測值相比誤差小于1%。因此，利用響應面分析方法對黃參胡蘿卜凝固型復合酸乳的工藝條件進行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效地減少工藝操作的盲目性，從而為進一步的實驗研究提供參考。

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