劉 玲，蔣然然，彭海鑫，李艷芳，任陽陽，肖安蓬，陳 海，李樹紅*

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

鰱魚（Hypophthalmichthys molitrix）是我國主要淡水養(yǎng)殖品種，每年養(yǎng)殖產(chǎn)量371.39萬t，位居第2位[1]。鰱魚采肉率低，加工過程中產(chǎn)生大量下腳料和廢棄物，約占魚體的50%～60%[2]。研究表明魚類內(nèi)臟、卵巢、睪丸、魚皮、血漿等加工廢棄物中，均存在半胱氨酸蛋白酶抑制因子（cysteine proteinase inhibitors，CPIs）活性[3]。

CPIs是一類專門抑制活性中心含有半胱氨酸（Cy-SH）殘基的蛋白酶的抑制因子[4]。目前，盡管對陸生哺乳動物來源CPIs的研究相對較深入。但由于魚類進化地位和生存環(huán)境的明顯差異，魚類來源CPIs很可能具有某些特殊的性質(zhì)或活性。然而，在此方面的研究尚十分有限。此外，在食品領(lǐng)域已有研究表明魚類來源的Cystatins可有效抑制魚糜凝膠軟化相關(guān)熱穩(wěn)定蛋白酶[5-7]，因此推測有望開發(fā)為魚糜制品彈性改良劑。

目前除作者所在研究團隊從鰱魚卵中部分純化出了89 kD CPIs[8]外，有關(guān)鰱魚低分子CPIs的研究還未見報道。因此，本實驗在對鰱魚卵低分子CPIs粗分離進行條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，進一步對其純化鑒定，并初步測定了鰱魚低分子CPIs對改善鰱魚魚糜凝膠強度的作用效果，以便為后續(xù)深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

懷卵期（Ⅳ期）鰱魚于四川崇州通威養(yǎng)殖中心采集，宰殺后立即采卵，液氮速凍后于－80℃超低溫冰箱凍藏，使用前4℃解凍。

熒光合成肽（benzyloxycarbonyl-L-phenylalany-L-arginyl-4-methyl-7-coumarylamide，Z-Phe-Arg-MCA）、偶氮酪蛋白（azocasein）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、明膠、熒光標品（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）、十二烷基硫酸鈉（sodiu mdodecyl sulfate，SDS）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、甲叉雙丙烯酰胺（N,N’-methylenebisacrylamide，Bis）、過硫酸銨（ammonium persulfate，Aps） 美國Sigma公司；木瓜蛋白酶 成都康迪生物技術(shù)有限公司；蛋白濃度試劑盒 南京建成生物工程研究所；SP Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 美國GE公司；中分子質(zhì)量Marker（14.4～94 kD） 北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BR4i大容量高速冷凍離心機、Varioskan全波長多功能酶標儀 美國Thermo公司；PHS-320酸度計 成都世紀方舟有限公司；Biologic Duo Flow全自動中高壓層析系統(tǒng)、Mini Protein3垂直電泳槽、PowerPac 3000電泳電源、Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；Ultra-8050超濾杯 美國Millipore公司；TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 鰱魚卵CPIs粗提取條件的篩選

分別取鰱魚卵（約30 g）用4倍體積的不同pH值的3種提取緩沖液（Ⅰ：含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.0；Ⅱ：含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；Ⅲ：含0.1 mmol/L PMSF的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液，pH 8.0）勻漿，10 000×g離心20 min取上清液，經(jīng)4 層紗布過濾后得CPIs勻漿液。取最佳勻漿緩沖液提取的粗提物，進行不同條件的酸堿處理。即勻漿液4℃用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至3.0或4.0，再分別于4℃或30℃靜置10 min，此后于4℃用1 mol/L NaOH分別回調(diào)至pH值至6.0或8.0。最后10 000×g離心10 min取上清為最終的粗提液。以上步驟除特殊說明外，均在4℃操作。采用下述Azocasein法檢測各勻漿液、酸堿處理后的粗提液的總活力和比活力，篩選適宜的粗分離條件。

1.3.2 蛋白質(zhì)量濃度的測定

采用Bradford法[9]，按照試劑盒說明，測定各步驟所得粗提取液的蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3 CPIs抑制活性的測定

1.3.3.1 Azocasein法

Azocasein法參考Li Dekun等[5]方法，以Azocasein為底物測定粗提取各步驟的總活力和比活力。調(diào)節(jié)CPIs的加入量，使測定的其對木瓜蛋白酶水解Azocasein活性的抑制率處于30%～70%之間[10]。CPIs抑制活性單位定義為：在反應(yīng)條件（37℃，pH 7.0）下，440 nm波長處吸光度降低0.01即為1個單位。

1.3.3.2 熒光合成肽底物法

層析過程中，以靈敏度更高的熒光合成肽Z-Phe-Arg-MCA為底物，于激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm下監(jiān)測洗脫物對木瓜蛋白酶活性的抑制情況，具體參照Anastasi等[11]方法。調(diào)節(jié)CPIs的加入量，使測定的抑制率在30%～70%之間[10]。1個酶活力單位定義為：在反應(yīng)條件（40℃、pH 6.8）下，能夠在1 min內(nèi)水解底物并釋放出1 nmol/L AMC產(chǎn)物的酶活性量（1 nmol AMC/min）。1個抑制活性單位定義為：抑制1個單位的酶活性。

1.3.4 鰱魚卵低分子CPIs的層析純化

粗提液用Amicon YM-3超濾膜（截留分子質(zhì)量為3 kD）濃縮，透析（A液：20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH6.0）后進行SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析。SP Sepharose Fast Flow柱（2.6 cm×15 cm）首先用A液壓實、平衡。微濾后的粗提液上樣，用A液洗去不吸附的蛋白，然后用含0～1 mol/L NaCl的A液進行梯度洗脫。流速6.7 mL/min，每分鐘收集一管。熒光合成肽底物法測定每個收集管中的CPIs抑制活性。收集的活性部分，濃縮、微濾后上Sephacryl S-200分子篩層析柱（1.0 cm×90 cm）。用含0.2 mol/L NaCl的A液洗脫，流速0.07 mL/min，每管收集1.0 mL。熒光合成肽底物法測定每個收集管中的CPIs抑制活性。收集活性部分經(jīng)濃縮作為最終純化物。

1.3.5 鰱魚卵低分子CPIs的SDS-PAGE鑒定

Sephacryl S-200分子篩層析收集的活性部分，濃縮、適當透析（A液）后進行還原性SDS-PAGE。另取濃縮的CPIs收集液（小于2.5 μg）與0.625 μg的木瓜蛋白酶混合，置于37℃水浴反應(yīng)5 h以上，煮沸5 min后，再進行還原性SDS-PAGE。2.5 μg的BSA與0.625 μg的木瓜蛋白酶混合液，經(jīng)相同處理后作為對照樣。

SDS-PAGE按照Laemmli[12]的方法。采用17%分離膠和4%濃縮膠，每泳道上樣20 μL，120 V穩(wěn)壓下電泳約2 h。考馬斯亮藍R-250染色，脫色液（95%乙醇、冰醋酸、蒸餾水體積比4.5∶0.5∶5）脫色至電泳條帶清晰可見。

1.3.6 鰱魚卵低分子CPIs的明膠底物-SDS-反相酶譜法鑒定

鰱魚卵低分子CPIs的反相酶譜電泳基本參照Saitoh等[13]的方法。不同之處在于，同時以比樣品質(zhì)量濃度稍高的BSA做CPIs反相酶譜電泳的對照。此外，復性后的凝膠用含0.4 mg/mL的木瓜蛋白酶的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）在4℃反應(yīng)1 h，隨后用含1%明膠的50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）在37℃反應(yīng)12 h。

1.3.7 鰱魚魚糜凝膠的制備

魚糜凝膠的制備基本參考Nakamura等[14]的方法進行。取新鮮鰱魚背部白肉，絞碎，漂洗脫水后，添加10%碎冰空擂，再加入3% NaCl鹽擂，得魚糜（操作溫度低于10℃）。實驗組取適量魚糜，以1 g鰱魚肉糜加入5個活性單位（Azocasein法）的CPIs純化液后，填入直徑為12 mm的5 mL離心管中，5 000×g離心5 min。采用二段加熱法，即首先50℃加熱1 h，然后置于90℃水浴鍋中繼續(xù)加熱20 min。對照組加入與實驗組CPIs純化液相同體積的超純水，其余操作同實驗組。90℃加熱后，所有的凝膠立刻在冰水中冷卻30 min，4℃存放過夜備用。

1.3.8 魚糜凝膠強度的測定

魚糜凝膠在室溫放置2 h后，將其切成高度20 mm的均一圓柱體。于TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀上檢測各組凝膠的破斷力和凹陷深度。以破斷力與凹陷深度的乘積計算凝膠強度。

凝膠強度/（g·mm）=破斷力/g×凹陷深度/mm

采用壓縮模式，參數(shù)設(shè)定為：壓縮距離14 mm，測試速率1 mm/s，觸發(fā)力5.0 g，5 mm的圓球形探頭（P/0.25S）。對照組和實驗組每組取8個試樣測定即8次重復，采用SPSS19.0數(shù)學軟件進行統(tǒng)計分析，計算各指標的平均值和標準差，采用One-Way ANOVA法進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鰱魚卵CPIs粗提取條件的篩選

由表1可知，緩沖液Ⅰ所得鰱魚卵CPIs勻漿樣的總活力在3種勻漿緩沖液提取樣中最低（P＞0.05或0.01＜P＜0.05），但是其比活力最高，為3.49 U/mg，極顯著高于其他兩組（P＜0.01）。提示pH 6.0的勻漿液緩沖液Ⅰ更適合鰱魚卵CPIs的粗提取，因此勻漿步驟選擇此緩沖液作為提取液。

表2 鰱魚卵CPIs酸堿處理條件的篩選Table2 Selection of optimal acid-base treatment conditions for CPIs from silver carp eggs

由表2可知，經(jīng)1 mol/L HCl調(diào)節(jié)至pH3.0的各組樣液中CPIs抑制比活力均極顯著（P＜0.01）高于pH 4.0酸處理的各組樣液，尤其以pH 3.0酸處理后30℃放置10 min后回調(diào)pH 8.0的處理條件下比活力最高，因此，最終第4組處理條件作為適宜的粗分離條件。此條件下CPIs的比活力（57.72 U/mg）與最適勻漿步驟比活力（3.49 U/mg）相比，提高了15.54倍，說明30℃、pH 3.0酸處理10 min而后回調(diào)pH 8.0，去除了大部分酸堿不穩(wěn)定及一部分熱不穩(wěn)定的雜蛋白。

2.2 鰱魚卵CPIs的層析純化

實驗選取了鰱魚卵CPIs pH 3.0酸處理中的第4組和pH 4.0酸處理中的第8組樣液（除酸處理pH值不同外，其他處理條件相同），經(jīng)適當濃縮、透析后，分別上SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析，進一步分析pH 3.0酸處理的純化效果（圖1、2）。兩組樣品陽離子層析后均分離得到4個活性部分，即CPI-Ⅰ、CPI-Ⅱ、CPI-Ⅲ、CPI-Ⅳ。但與pH 4.0相比，pH 3.0處理組的顯著特點是活性峰CPI-Ⅱ的紫外吸收峰明顯降低，說明pH 3.0酸處理的顯著純化作用在于高效除去了活性峰Ⅱ中的雜蛋白，使CPI-Ⅱ比活力提高了48.22倍（表3）。本研究繼續(xù)選此部分進行下一步的Sephacryl S-200分子篩層析（圖3），再次除去了較多高分子質(zhì)量的雜蛋白，并在低分子部分呈現(xiàn)3個活性峰，編號分別為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c，其中Ⅱ-b、Ⅱ-c的比活力分別為1 098.59U/mg和1 769.23 U/mg，純化了312.10、502.62倍。

圖1 pH 3.0酸處理后鰱魚卵CPIs的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析Fig.1 SP Sepharose fast flow chromatography of crude CPIs extract after acidification at pH 3.0

圖2 pH 4.0酸處理后鰱魚卵CPIs的SP Sepharose Fast Flow陽離子交換層析Fig.2 SP Sepharose fast flow chromatography of CPIs crude extract after acidification at pH 4.0

圖3 陽離子層析收集的鰱魚卵CPIs-Ⅱ的Sephacryl S-200分子篩層析Fig.3 Sephacryl S-200 chromatography of CPIs-Ⅱ collected from SP Sepharose fast flow chromatography

表3 鰱魚卵小分子CPIs組分Ⅱ-b和Ⅱ-c的純化結(jié)果Table3 Purification of Ⅱ--b and Ⅱ-c from silver carp eggs

2.3 鰱魚卵CPIs的SDS-PAGE

圖4 Sephacryl S-200分子篩層析后收集的鰱魚卵CPIs部分的SDS-PAGE Fig.4 SDS-PAGE of CPIs from silver carp eggs after Sephacryl S-200 chromatography

由圖4可知，電泳后，Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c在低分子質(zhì)量部分均呈現(xiàn)了清晰的條帶。其中Ⅱ-a除在23、16 kD（圖4中泳道1中箭頭所示）處有明顯低分子條帶外，尚含較多的高分子質(zhì)量成分，Ⅱ-b僅在約16、10、7 kD（圖4泳道2中箭頭所示）處呈現(xiàn)了3 條帶，而抑制活性最高的Ⅱ-c僅在10 kD和7 kD（圖4泳道3中箭頭所示）附近呈現(xiàn)兩條帶。但Ⅱ-b及Ⅱ-c的7 kD處條帶均稍呈彌散狀態(tài)，其中很可能還混有沒有分開的其他小蛋白組分。綜合電泳圖譜及純化倍數(shù)，說明適宜的酸堿處理條件加上SP Sepharose Fast Flow和Sephacryl S-200兩步層析，能除去大部分雜蛋白，使鰱魚卵中部分低分子CPIs得到了快速有效的純化。

2.4 鰱魚卵CPIs抑制條帶的電泳鑒定

圖5 鰱魚卵低分子CPIsⅡ-b的明膠底物-SDS-反相酶譜鑒定Fig.5 Identification of Ⅱ-b by gelatin-SDS-reverse zymography

采用明膠底物-SDS-反相酶譜法進行抑制條帶鑒定，以質(zhì)量濃度稍高于樣品的BSA做對照，對Ⅱ-b進行抑制條帶的鑒定，由圖5可知，37℃反應(yīng)12 h后，在BSA尚未完全水解時，Ⅱ-b已經(jīng)消失，即在反相酶譜電泳中Ⅱ-b沒有體現(xiàn)出抑制活性，說明該方法并不適合鑒定鰱魚卵低分子CPIs。

圖6 Ⅱ-b及Ⅱ-c與木瓜蛋白酶反應(yīng)后抑制條帶的SDS-PAG鑒定Fig.6 Identification by SDS-PAGE of Ⅱ-b and Ⅱ-c after reaction with papain

將Ⅱ-b和Ⅱ-c（均小于2.5 μg）與0.625 μg木瓜蛋白酶在適宜條件下反應(yīng)后，進行SDS-PAGE檢測，并以2.5 μg的BSA作為對照。由圖6可知，0.625 μg的木瓜蛋白酶能徹底水解2.5 μg BSA（泳道3），但同樣水解條件下，Ⅱ-b中僅16 kD條帶消失（泳道8），而10 kD和7 kD的蛋白條帶幾乎沒有變化，表明二者能夠抑制半胱氨酸蛋白酶的水解作用。Ⅱ-c與木瓜蛋白酶反應(yīng)前后，其10 kD和7 kD處的蛋白條帶亦幾乎沒有變化。因而初步判斷Ⅱ-b及Ⅱ-c中均存在10 kD和7 kD的低分子抑制因子，但由于7 kD條帶呈彌散態(tài)，因此推測Ⅱ-b及Ⅱ-c中也可能同時存在低于7 kD的抑制因子，具體成分及種類還有待鑒定。

2.5 鰱魚卵CPIs對鰱魚魚糜凝膠強度的影響

魚糜凝膠軟化的抑制研究表明，當Ⅱ-b、Ⅱ-c在鰱魚糜中的添加量為5 U/g（Azocasein法）時，明顯抑制了魚糜凝膠軟化。由圖7可知，相對于對照組凝膠強度分別增加了48.77%（P＜0.01）和55.55%（P＜0.01），但二者之間差異不顯著（P＞0.05），說明Ⅱ-b中16 kD雜蛋白對鰱魚低分子CPIs抑制魚糜凝膠軟化的作用影響不大。

圖7 添加CPIs對魚糜凝膠強度的影響Fig.7 Effects of added CPIs on gel strength of surimi

3 討 論

盡管對魚類CPIs的研究有限，但相關(guān)報道均表明在魚類CPIs粗分離過程中，根據(jù)其具有較寬的pH值穩(wěn)定范圍，可采用酸堿處理提高純化效率。Yamashita等[15]在純化大麻哈魚（Oncorhynchus keta）卵低分子（16 kD及11 kD）CPIs時，即采用了pH 3.0～6.0的酸堿處理提取條件。劉健安等[16]從鯽魚（Carassius aumtus）卵中分離低分子CPIs（14 kD和9.2 kD）時，同樣采用pH 4.0～8.8的酸堿處理，比活力提高2.09倍。本實驗中，在適宜粗提條件下（30℃時pH 3.0處理10 min，回調(diào)pH 8.0），類似地鰱魚卵CPIs比活力提高了15.45倍，進一步通過陽離子交換層析，證明酸堿處理主要除去的是CPI-Ⅱ部分的雜蛋白，對CPIs的抑制活性影響不大。因此，推測實驗所得兩部分鰱魚卵低分子CPIs（Ⅱ-b和Ⅱ-c）具有耐受pH 3.0至pH 8.0及30℃的良好酸堿穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性。

Cystatins超家族[17]是動物源CPIs的最主要類群，其劃分為低分子質(zhì)量的家族Ⅰ Stefin（約11 kD）和家族Ⅱ Cystatin（約13 kD），以及高分子質(zhì)量的家族ⅢKininogen（約50～120 kD）[4,18]。此外低分子質(zhì)量的Thyropins家族[19]、類前體肽類[20]等抑制劑也屬于動物源CPIs的類群。在魚類中，除發(fā)現(xiàn)18 kD的類Stefin[6]、12 kD[21]、16.8 kD[22]、17 kD[22]的Cystatin外，也證實存在低分子的（6、9、11 kD）Thyropins家族CPIs[15,23]和類前體肽CPIs[20]。日本鰻魚（Anguilla japonica）皮中還分離到了16 kD的類凝集素類新型低CPI[24]。本實驗中低分子活性部分Ⅱ-b和Ⅱ-c經(jīng)電泳分析鑒定，初步判斷除10 kD和7 kD外，還可能包括分子質(zhì)量更低的CPIs，它們是否分屬于CPIs的不同類群，但是還有待進一步分離純化和分類鑒定。

明膠-底物-SDS-PAGE反相酶譜法無法成功鑒定純化的鰱魚卵低分子CPIs，這可能與魚種有關(guān)，鰱魚卵CPIs的活性較低。此外，此法中所用的非離子型去垢劑SDS可能導致了鰱魚CPIs結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，致使其活性減弱或失活。研究表明鯉魚Cystatin（家族Ⅱ）表面均勻分布正電荷[25]，帶負電荷的SDS很可能改變Cystatin構(gòu)象，從而影響其活性。而Ⅱ-b和Ⅱ-c與木瓜蛋白酶在適宜條件下反應(yīng)后，再進行SDS-PAGE分析，則可能避免了SDS對其結(jié)構(gòu)和活性的影響，因此使得抑制條帶得到鑒定。

目前采用直接添加分離純化的魚源低分子CPIs抑制魚糜凝膠軟化的研究寥寥無幾，通常是以重組低分子CPIs作為研究對象[26]，其實際應(yīng)用受限。因此，深入研究天然的魚源CPIs的活性特征及對魚糜凝膠軟化的抑制效果，具有重要意義。魚糜凝膠化的最適pH值范圍通常在6.5～7.5，同時本實驗中經(jīng)pH 3.0～8.0酸堿處理后得到的低分子CPIs，在pH 6.5～7.5范圍內(nèi)應(yīng)具有較好穩(wěn)定性。此外，鰱魚魚糜在50℃最易發(fā)生凝膠軟化[27]。盡管本實驗中Ⅱ-b和Ⅱ-c是部分純化的小分子CPIs，但實驗證明添加Ⅱ-b和Ⅱ-c后，在50℃條件下凝膠化的鰱魚魚糜凝膠強度顯著增加（P＜0.01），說明鰱魚卵低分子CPIs能夠提高鰱魚魚糜的凝膠形成能，具有開發(fā)為魚糜彈性改良劑的應(yīng)用前景。但是為了更充分有效的利用鰱魚卵中CPIs資源，目前還有待對其中的CPIs進行系統(tǒng)的分離純化，深入鑒定其分類及生物學活性特征。

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