王立峰，王玉梅，張 晶，謝慧慧，鞠興榮

（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023）

我國油菜種植面積和總產(chǎn)量占世界30%左右，居于世界首位[1]。油菜籽是重要的植物蛋白質(zhì)資源，去油后的菜籽餅粕中約含有30%～45%的蛋白質(zhì)，菜籽蛋白主要由12S球蛋白和2S清蛋白組成[2]。以菜籽蛋白為原料可通過降解得到小分子的菜籽多肽，某些小分子菜籽肽吸收快、耗能低、吸收率高，并且在抗氧化、降血壓、抗腫瘤等方面顯示重要的生物活性[3]。郭興鳳等[4]研究表明菜籽蛋白的酶水解產(chǎn)物具有抗氧化活性；薛照輝等[5]利用雙酶分步水解菜籽清蛋白后，經(jīng)Sephadex G-25凝膠層析柱分離純化，得到分子質(zhì)量降級的3個組分，經(jīng)過實驗表明，這些菜籽肽具有較強的還原能力及抑制羥自由基（?OH）的作用；Yoshie-Stark等[6]以菜籽分離蛋白為底物經(jīng)酶水解后得到的菜籽多肽具有顯著的1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力。有研究學者認為[7]，菜籽肽由于富含供氫體，所以具有提供氫質(zhì)子的能力，使具有高度氧化性的自由基還原，從而能終止自由基連鎖反應，起到清除或抑制自由基的作用。目前評價抗氧化活性最為簡便、靈敏的為抗氧化自由基吸收能力法[8]（oxygen radical absortion capacity，ORAC）。Wolf等[9]建立了細胞內(nèi)測定抗氧化活性的方法（cellular antioxidant capacity，CAA），從細胞層次上反映抗氧化劑的吸收代謝的情況。本實驗主要是用堿性蛋白酶水解菜籽蛋白后通過聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱（Sephacryl S-100HR）分級得到不同組分的菜籽蛋白水解物（rapeseed protein hydrolysates，RPHs），通過體外ORAC和細胞內(nèi)CAA兩種抗氧化評價方法分析各組分RPHs的抗氧化性，篩選出抗氧化性較高的組分，并對其進行氨基酸分析，確定組分中氨基酸組成，為后續(xù)菜籽肽功能性的機理研究提供一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2人體肝癌細胞 上海細胞庫；甘藍型“雙低”油菜籽秦優(yōu)7號，購于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院種子公司，樣品脫殼后，石油醚索氏抽提去脂，通風櫥中平鋪晾干，旋風磨粉碎過100 目篩后備用。

Sephacryl S-100HR凝膠填料 美國GE公司；多肽聚丙烯酰胺凝膠電泳分子質(zhì)量標準物 美國Bio-Rad公司；Alcalase 2.4L 丹麥諾維信公司；N,N’-甲叉雙丙烯胺、Tris、過硫酸銨、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate，SDS）、N,N,N’,N’-四甲基二乙胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、兩性離子緩沖液（Tricine）、考馬斯亮藍R-250、溴酚藍和β-巰基乙醇、熒光素鈉鹽（fluorescein sodium salt，F(xiàn)L）、自由基產(chǎn)生劑AAPH（2,2’-azobis-2-amidinopropanedihydrochloride）、抗氧化標準物質(zhì)水溶性VE（6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）美國Sigma公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（青霉素10 000 U/mL，鏈霉素10 000 U/mL）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液（0.25%）、Hank平衡鹽溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS）等細胞培養(yǎng)試劑 美國Gibco生物技術公司。

1.2 儀器與設備

E-812索氏抽提裝置 南京晚晴化玻儀器有限公司；Beckman Coulter J6冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；FreeZone 2.5L臺式冷凍干燥機 美國Labconco公司；Mini-P4微型垂直電泳儀 美國Bio-Rad公司；Millipore Pellicon XL小型超濾裝置 美國Merck Millipore公司；SpectraMax M2e酶標儀 美國Molecular Devices公司；HERAcell 150i二氧化碳培養(yǎng)箱、MSCAdvantage-1.2生物安全柜 美國Thermo Scientific公司；HL-2恒流泵、HD-3紫外檢測儀、BSZ-100自動收集器、XWT-S小型臺式記錄儀 上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 RPHs的制備

按照本實驗室的方法制備。稱100 g菜籽粉溶于2 000 mL的蒸餾水，調(diào)pH值為11左右，室溫攪拌1 h后于4 000×g離心分離10 min，收集上清液。調(diào)節(jié)上清液的pH值為4.5，靜置30 min，4 000×g離心分離10 min后棄上清液，用95%的乙醇洗滌沉淀2次，冷凍干燥得菜籽蛋白。取20 g按上述步驟所得到的菜籽蛋白溶于400 mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為9，加入400 μL的堿性蛋白酶酶解液，溫度控制在50℃，酶解過程維持pH值不變，5 h后水浴滅酶15 min，冷卻后調(diào)pH值至4.5，30 min后，離心分離20 min（4℃，10 000×g），收集上清液，將其pH值調(diào)至7.0，過0.45 μm微濾膜，冷凍干燥后得RPHs。

1.3.2 Sephacryl S-100HR過濾

將得到的RPHs配成0.01 g/mL的溶液，經(jīng)過由層析柱、恒流泵、自動部分收集器和紫外檢測器組成的液相色譜分離層析系統(tǒng)，于紫外波長280 nm、洗脫流速60 mL/h的條件下先后收集得到3個不同的組分的菜籽肽，冷凍干燥后儲存于－20℃，備用。

1.3.3 菜籽肽各級分的抗氧化能力指數(shù)ORAC分析

參照文獻[10]方法，反應于96 孔板中進行，每個孔加入20 μL RPHs樣品溶液（質(zhì)量濃度為0.04 mg/mL）或者20 μL不同質(zhì)量濃度的Trolox標準品，RPHs各級分樣品用75 mmol/L的磷酸緩沖液稀釋，之后加入200 μL的熒光指示劑（0.96 μmol/L），在酶標儀中溫育后（37℃，15 min），每孔再加入20 μL現(xiàn)配的119 mmol/L偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamide）dihydrochloride，ABAP），于波長485 nm處激發(fā)，每5 min在波長520 nm處釋放測定。各樣品組均設3～5個復孔。ORAC值用Trolox當量（μmol TE/g）表示。

1.3.4 Hep G2細胞的MTT毒性實驗

取對數(shù)生長期Hep G2細胞，于96 孔中每孔接種104個細胞，細胞液的加入量為100 μL，于37℃、5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，向每孔中加入100 μL不同質(zhì)量濃度的樣品，每個質(zhì)量濃度均設5個復孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，于每孔中再加入20 μL的MTT（5 mg/mL），培養(yǎng)4 h后吸出舊的培養(yǎng)液，加入150 μL的DMSO，37℃條件下輕微振蕩30 min，待充分溶解形成深藍色結晶后，于酶標儀波長570 nm處測定OD值，對照組以等體積細胞培養(yǎng)液代替樣品溶液。按照公式（1）計算細胞存活率。

式中：OD1為樣品光密度值；OD0為對照組光密度值。

1.3.5 細胞抗氧化活性實驗

采用文獻[11]的方法進行細胞抗氧化活性實驗，于96 孔板上按密度6×104個/每孔接種Hep G2細胞，細胞液加入量為100 μL，于細胞培養(yǎng)箱中（37℃、5% CO2）培養(yǎng)24 h后棄去舊培養(yǎng)液，用PBS清洗接種孔，再加入100 μL RPHs樣品處理液（用同等體積的樣品稀釋液：25 μmol/L二氯熒光黃二乙酸酯（dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）稀釋），繼續(xù)培養(yǎng)1 h后棄去舊的培養(yǎng)液，加入100 μL的600 μmol/L的ABAP，放入熒光酶標儀中讀數(shù)，于恒溫37℃，波長538 nm處激發(fā)，每5 min在波長485 nm處釋放測定1 h。參照公式（2）計算細胞抗氧化能力。

式中：∫SA表示RPHs樣品曲線下的積分面積；∫CA表示對照組曲線下的積分面積。樣品的半數(shù)有效濃度（EC50）以lg（?a/?u）對lgρ的中效原理來計算，這里?a表示樣品作用效應（CAA），?u表示1－CAA，ρ表示RPHs質(zhì)量濃度。EC50值以3次平行實驗計算得出，將EC50值轉(zhuǎn)化為CAA值，以每克樣品中相當于槲皮素的微摩爾當量來表示。

1.3.6 統(tǒng)計分析

相關性分析采用SPSS17.0軟件中的Correlate進行分析。樣品間差異顯著性采用SPSS17.0軟件中單因素方差分析中的最小顯著性檢驗和Duncan’s多重比較分析，顯著水平設為P＜0.05。

1.3.7 RPHs各級分的凝膠電泳

電泳凝膠及緩沖液的配制參照文獻[12]中Tricine-SDS-PAGE的配制方法，并做適當修改，采用16.5%分離膠和5%的濃縮膠。具體方法如下：將通過Sephacryl S-100HR凝膠柱的RPHs各級分配成10 mg/mL的溶液，與樣品緩沖液按體積1∶1混合，100℃煮沸5 min，上樣量為10 μL，電壓100 V，時間為2～3 h后于固定液中固定20 min，考馬斯亮藍G-250染色30 min，過夜脫色，待膠片背景藍色呈透明狀時拍照，觀察并分析RPHs各級分的分子質(zhì)量分布。

1.3.8 氨基酸組分分析

在10 mL玻璃水解管中稱取RPHs樣品后，加入6 mol/L的鹽酸，用氮氣置換并在減壓狀態(tài)下使用酒精噴燈迅速封管，在110℃條件下水解反應24 h；反應結束后打開水解管，濃縮水解液，用0.02 mol/L的鹽酸溶解后用去離子水稀釋至50 mL；然后以1 500 r/min 離心5 min，所得上清液過0.22 μm濾器后移入2 mL樣品瓶中，采用氨基酸自動分析儀中進行氨基酸組分分析。

2 結果與分析

2.1 RPHs的分離純化

RPHs的樣品液（0.01 g/mL）于60 mL/h的洗脫流速，波長2 8 0 n m的紫外檢測條件下經(jīng)過Sephacryl S-100HR凝膠柱層析分離，按照洗脫時間和紫外檢測的OD280nm值作圖，可以得到3個洗脫峰，如圖1所示。分別收集所得到的3個組分，冷凍干燥后進行抗氧化分析。

圖1 Sephacryl S-100HR純化RPHs的柱層析圖Fig.1 Column chromatography of RPHs on Sephacryl S-100HR

2.2 RPHs及其各組分的ORAC分析

ORAC法是目前評價抗氧化物質(zhì)抗氧化活性的較為簡單、有效、靈敏度高、應用范圍廣的方法之一，提供了穩(wěn)定、可控的自由基，這些自由基與生物活動產(chǎn)生中的自由基相一致[13]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)多通道液體處理系統(tǒng)和微孔板分析儀的使用所測定的實驗結果更準確，實現(xiàn)了ORAC測定的自動化及高通量化，分析效率提高[14]。此方法已應用于生物樣品、水果蔬菜和果汁飲料等多種樣品的體內(nèi)、外抗氧化能力分析。本研究中，RPHs及凝膠柱分離的各組分的ORAC值見圖2。

圖2 RPHs與凝膠分離菜籽肽各組分的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant activities of three fractions of RPHs

由圖2可知，同其他的RPHs組分相比，組分3的ORAC值最高，達到（1 610.38±112.51）μmol TE/g。其體外抗氧化性顯著高于其他組分和原始蛋白水解物。曹亞蘭等[15]以ORAC值為評價指標來制備大豆抗氧化肽，結果發(fā)現(xiàn)，大豆蛋白經(jīng)Alcalase酶解產(chǎn)物的ORAC最高值可達1 900.48 μmol TE/g，與本實驗組分3的抗氧化性差別不大。

2.3 RPHs及其各組分對細胞毒性的影響

驗證RPHs及各組分對Hep G2細胞的抑制作用是源于其潛在的細胞毒性，本研究采用MTT的方法測定了RPHs和各組分對Hep G2細胞是否具有細胞毒性作用。配制25～400 mg/L質(zhì)量濃度的RPHs培養(yǎng)Hep G2細胞24 h后，通過與對照組細胞的OD570nm值的變化可以比較測定出樣品的細胞毒性，結果見圖3。

圖3 RPHs及凝膠柱分離各組分對細胞毒性的影響Fig.3 Cytotoxicity of RPHs and three fractions using MTT assay

由圖3可知，RPHs各組分中200、400 mg/L的質(zhì)量濃度組可以顯著抑制HepG2細胞的增殖；當質(zhì)量濃度為400 mg/L時，樣品各組分都顯示了一定的細胞毒性，細胞存活率降為70%左右；當質(zhì)量濃度為200 mg/L時，RPHs和組分1產(chǎn)生了較強的細胞毒性。組分2和組分3處理的細胞組在25～200 mg/L質(zhì)量濃度范圍，細胞存活率均達到75%以上，表明無明顯的細胞毒性；因此，在后續(xù)實驗中將以此范圍作為依據(jù)，作為無細胞毒性的使用劑量。

2.4 RPHs及各組分的細胞抗氧化分析

本實驗中細胞抗氧化能力的測定是直接采用不使用PBS清洗的測定方法，即加入RPHs及各組分樣品培養(yǎng)1 h后，不使用PBS清洗細胞孔，直接加入含有ABAP的處理液進行熒光檢測。RPHs及各組分細胞抗氧化能力的EC50值見圖4。RPHs及其各組分抗氧化性差異顯著，其中組分1的EC50最高，為（187.39±21.71）μg/mL，組分3的EC50的最低，為（57.84±3.38）μg/mL，組分3的抗氧化效果最好。

圖4 RPHs及凝膠柱分離各組分細胞抗氧化的EC5500值Fig.4 EC50 values of RPHs and three fractions

圖5 RPHs及凝膠柱分離各組分細胞抗氧化CAA值Fig.5 CAA values of RPHs and three fractions

RPHs及各組分的細胞抗氧化CAA值見圖5。經(jīng)過比較可看出組分3的CAA值最高為（124.66±2.18）μmol QE/g，相對應的組分1的CAA值最低為（28.96±0.31）μmol QE/g。

2.5 相關性分析

對RPHs及各組分的ORAC值和CAA值之間的相關性進行分析，其Pearson相關系數(shù)為0.838，相關系數(shù)的顯著水平為0.001，說明細胞內(nèi)抗氧化活性（CAA法）和體外抗氧化活性（ORAC法）兩者之間具有極顯著的相關性（P＜0.05）。

2.6 RPHs及各組分的Tricine-SDS-PAGE電泳

圖6 RPHs及各組分的凝膠電泳圖Fig.6 Electrophoretic patterns of RPHs and three fractions

圖6反映出RPHs及各組分的分子質(zhì)量的排布，組分3的分子質(zhì)量集中在1 423～3 496 D之間，組分2的分子質(zhì)量則集中在6 512～14 437、1 423～3 496 D之間，組分1的分子質(zhì)量集中在26 625 D上下，RPHs的分子質(zhì)量主要集中在26 625、6 512～14 437、3 496 D這3個范圍。由以上實驗可看出不同組分RPHs的ORAC值變化規(guī)律與CAA值相同，其抗氧化活性大小表現(xiàn)為：組分3＞RPHs＞組分2＞組分1。其中組分3顯示較強的抗氧化性，其分子質(zhì)量分布集中在1 423～3 496 D之間。有研究結果也顯示了蛋白降解物的抗氧化性與它們的分子質(zhì)量分布有著一定的關系[16-17]。Xie等[18]水解苜蓿葉蛋白得到的抗氧化肽的分子質(zhì)量主要集中在1 000 D以下。Li等[19]通過水解鷹嘴豆蛋白得到抗氧化活性較高的組分的分子質(zhì)量集中在940～2 622 D之間和220～940 D之間。這些結果都表明肽的分子質(zhì)量分布與其抗氧化活性有著內(nèi)在的聯(lián)系。

2.7 氨基酸組分分析

由ORAC和CAA實驗得出組分3的抗氧化性明顯大于其他各組分和RPHs樣品，對抗氧化性最好的組分3進行氨基酸分析。氨基酸分析結果見表1，可知組分3中Glu、Gly、Ala、Tyr、Pro等氨基酸的含量較高。多肽的抗氧化活性的強弱與氨基酸組成、種類、疏水性以及在肽鏈中的位置有關[20-21]，研究發(fā)現(xiàn)Cys、Met、Tyr、Lys、Arg、Glu、Asp、Ser、Pro、Phe、Ala以及His都是具有一定抗氧化活性的氨基酸，它們在序列中出現(xiàn)能夠不同程度的增強多肽抗氧化特性[22-23]。此外，組分3中必需氨基酸占總含量的18.23%，因此也具有比較高的營養(yǎng)價值。

表1 組分3的氨基酸組分分析Table1 Amino acid composition of fraction 3

3 結 論

本實驗研究了RPHs及凝膠過濾各組分的抗氧化能力分析，利用體外抗氧化法（ORAC）和細胞內(nèi)抗氧化法（CAA）評價其抗氧化性。結果表明，ORAC值與CAA值具有相同變化規(guī)律，其抗氧化活性大小表現(xiàn)為：組分3＞RPHs＞組分2＞組分1。其中組分3抗氧化活性最強，其分子質(zhì)量集中處于1 423～3 496 D之間，除此之外，菜籽蛋白水解物的抗氧化活性可能還與其氨基酸組成有關。

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