張 勤 徐曉虹,2 劉幸毅 董芳妮 楊艷玲 張廣俠

(1浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院; 2浙江師范大學(xué)心理研究所, 浙江金華 321004)

1 前言

雙酚A (bisphenol-A, BPA)是酚類化合物中具有代表性的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物, 是全球產(chǎn)量最高的化合物之一, 2011年產(chǎn)量高達(dá)1000萬鎊, 廣泛用于生產(chǎn)碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯樹脂,也用于制造阻燃劑、橡膠防老化劑、抗氧化劑、涂料等精細(xì)化工產(chǎn)品。BPA與人類日常生活密切相關(guān), 食品和飲料包裝、嬰兒奶瓶、牙科固封劑、熱敏紙等材料中普遍含有BPA (Vom, Nagel, Coe, Angle, & Taylor,2012)。BPA結(jié)構(gòu)與人工合成激素乙烯雌酚(Diethylstilbestrol, DES)類似, 與雌激素受體有一定的親和力, 具有擬雌激素、抗雌激素和抗雄激素活性(Negishi et al., 2003)。目前已知發(fā)育期BPA暴露可以影響嚙齒類動物成年后包括學(xué)習(xí)記憶、焦慮、社會交互等多種神經(jīng)行為(陳蕾, 徐曉虹, 田棟,2009; Gon?alves, Cunha, Barros, & Martínez, 2010;Kim et al., 2011; Ja?arevi? et al., 2013)。由于雌激素不僅影響腦的發(fā)育, 同時也參與成年腦的可塑性和認(rèn)知功能(Kim, & Casadesus, 2010; Barha, Dalton,& Galea, 2010), 因此, 成年期BPA暴露對嚙齒類動物腦和行為的影響受到關(guān)注。最近的研究發(fā)現(xiàn),BPA可減少正常雄性大鼠的突觸數(shù)目, 抑制睪丸摘除大鼠雄激素誘導(dǎo)的海馬 CA1區(qū)棘突觸的形成(Leranth, Szigeti-Buck, Maclusky, & Hajszan, 2008);BPA還可干擾成年小鼠的神經(jīng)可塑性而損傷記憶形成(Eilam-Stock, Serrano, Frankfurt, & Luine,2012)。

條件性恐懼(fear conditioning)的形成既是一種學(xué)習(xí)和記憶的過程, 也是一種情緒的形成過程, 它可以激發(fā)動物在面臨威脅時的一系列防御機(jī)能, 對動物的生存至關(guān)重要。條件恐懼模型廣泛用于恐懼記憶的研究, 通過對動物進(jìn)行厭惡性的不可逃避刺激(unconditioned stimulus, US), 如足底電擊, 與中性刺激(conditioned stimulus, CS)如燈光、聲音、環(huán)境等的配對訓(xùn)練, 使動物再次暴露于訓(xùn)練環(huán)境中時即表現(xiàn)出對CS的恐懼或焦慮反應(yīng), 如僵立(freeze)(Santos, Martinez, & Brand?o, 2006)。大量證據(jù)表明,杏仁核、海馬和內(nèi)側(cè)前額葉皮層在恐懼記憶的形成、保持及消退中起重要作用。毀損海馬可以破壞恐懼記憶的獲得與鞏固(Li et al., 2006)。條件恐懼引發(fā)的僵立反應(yīng)可被抗焦慮藥反轉(zhuǎn), 因此也是廣泛用于研究焦慮癥的模型。雌激素參與調(diào)節(jié)恐懼和焦慮行為, 苯甲酸雌二醇上調(diào)卵巢摘除小鼠的恐懼記憶和焦慮狀態(tài)(Morgan, & Pfaff, 2001), 據(jù)此, 我們推測環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 BPA可能影響小鼠的恐懼記憶。

學(xué)習(xí)記憶過程受表觀遺傳調(diào)節(jié), 組蛋白乙?；潜碛^遺傳調(diào)節(jié)的重要方式。四個核心組蛋白(H2A,H2B, H3和H4)的翻譯后修飾, 特別是組蛋白乙?；? 涉及到轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)和記憶的形成(Korzus,Rosenfeld, & Mayford, 2004; Wood et al., 2005)。有人發(fā)現(xiàn), 場景性條件恐懼(contextual fear conditioning)訓(xùn)練顯著上調(diào)海馬組蛋白H3 (histone 3)乙?；?這一過程依賴 N-甲基-D-天門冬氨酸(N-methy-D-aspartate, NMDA)和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)的活化,能夠被 NMDA受體拮抗劑或 ERK阻斷劑所阻斷(Levenson et al., 2004)。而且ERK可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子如 cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein, CREB)的活性, 由后者開啟記憶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。因此, 場景性條件恐懼記憶的形成需要 NMDA受體的開啟、ERKs的活化,以及最終的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Levenson et al., 2004)。假如BPA影響條件恐懼記憶, 那么是否與組蛋白乙?；母淖冇嘘P(guān)呢？本文將對此進(jìn)行探討。

2 實(shí)驗材料和方法

2.1 動物模型制備與分組

清潔級9周齡ICR雄性小鼠, 體重25~30 g, 購于浙江金華藥檢所。小鼠購入后隨機(jī)分籠飼養(yǎng), 晝夜 12小時交替, 室溫 26±2℃, 濕度 50~60%, 食物與水自由攝取。待小鼠適應(yīng)1周后, 隨機(jī)分為0.4、4、40 mg/kg/d BPA暴露組和花生油溶媒對照組(

n

=26), 每天上午8點(diǎn)開始灌胃BPA, 連續(xù)染毒90 d。染毒劑量根據(jù)前期實(shí)驗確定(劉幸毅 等, 2013)。每周稱量小鼠體重, 調(diào)整灌胃體積。染毒結(jié)束后三天進(jìn)行行為學(xué)檢測。

2.2 場景性條件恐懼行為訓(xùn)練和檢測

場景性條件恐懼實(shí)驗根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法(Chwang, O'Riordan, Levenson, & Sweatt, 2006; 吳冰, 胡波, 隋建峰, 2010)在有機(jī)玻璃室(30.5 cm ×30.5 cm × 43.5 cm)中進(jìn)行, 底部為導(dǎo)電的不銹鋼柵。將小鼠放入條件恐懼箱中適應(yīng) 3 min, 同時測定其僵立時間。24 hr后開始恐懼訓(xùn)練, 將小鼠放入原條件恐懼箱中適應(yīng)2 min后給予電擊(1 s, 45 V),間歇2 min后再次給予電擊, 共給予3次電擊。電擊結(jié)束后動物在條件恐懼箱中停留 30 s后放回鼠房。1 hr或24 hr后進(jìn)行恐懼記憶檢測。檢測時, 將小鼠再次放入條件恐懼箱內(nèi)3 min, 記錄3 min內(nèi)小鼠的僵立時間, 而后取出。每組有10只小鼠在恐懼訓(xùn)練后1 hr進(jìn)行記憶檢測, 另外10只小鼠在訓(xùn)練后24 hr檢測。僵立行為是一種普遍見于嚙齒類的防御行為, 表現(xiàn)為刻板式的蹲伏姿勢, 除呼吸運(yùn)動以外的所有肌肉運(yùn)動均消失至少1 s以上, 是嚙齒類恐懼表達(dá)的行為方式(Blanchard, & Blanchard,1969)。每個動物訓(xùn)練及測試完成后都用100%酒精清潔反射箱, 然后進(jìn)行下一只小鼠的行為操作。所有動物行為用小動物行為分析系統(tǒng)(TSE System GmbH, 德國)實(shí)時記錄。

2.3 蛋白樣品的制備

在條件恐懼訓(xùn)練前、訓(xùn)練后1 hr和24 hr每組分別隨機(jī)取6只小鼠(

n

= 6)斷頭取腦, 冰上分離雙側(cè)海馬保存于-80℃冰箱。按 1:10比例加入相應(yīng)體積的RIPA (強(qiáng))蛋白裂解液, 勻漿后, 4℃下12,000 g離心 10 min, 取上清加入上樣緩沖液后煮沸 3~5 min變性, 分裝, -20℃保存, 用于NMDA受體亞基NR1、ERK1/2、p-ERK1/2、組蛋白去乙?；?2(histone deacetylase 2, HDAC2)和β-actin的蛋白檢測。沉淀重懸于200 μl 0.25 M HCl, 4℃過夜, 4℃下12,000 g離心10 min, 取上清加入上樣緩沖液后煮沸3~5 min變性, 分裝, -20℃保存, 用于組蛋白H3和乙?；M蛋白H3K14的蛋白檢測。

2.4 Western blot分析

取 15~20 μl蛋白樣品按常規(guī)方法進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳。將蛋白濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜上后, 用 5%脫脂牛奶封閉 2 hr; 分別與一抗 NR1 (1:600, Santa Cruz Biotechnology, USA)、ERK1/2和p-ERK1/2 (1:400,Cell signaling Technology, USA)、H3K14 (1:1000,Upstate Biotechnology, USA)、HDAC2和H3 (1:1000,碧云天, 中國)、β-actin (1:1000, Cell signaling Technology, USA) 4℃孵育過夜, TBST (20 mmol/L Tris-HCl, pH = 7.5; 0.15 mmol/L NaCl)漂洗 3×10 min; 二抗孵育1 hr, 漂洗3×10 min; 顯色, 用免疫化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)反應(yīng) 1~2 min后, 用保鮮膜覆蓋NC膜, X-膠片(美國Kodak公司)曝光。掃描儀掃描蛋白條帶圖后, 用 Quantity one (Bio-rad Laboratories, USA)軟件半定量分析條帶光密度。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示, 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。場景性條件恐懼行為數(shù)據(jù)及蛋白檢測結(jié)果均采用重復(fù)雙因素(BPA暴露×電擊)方差分析(Two-way repeated ANOVAs), 然后進(jìn)行Tukey's 檢驗。

p

<0.05作為具有統(tǒng)計學(xué)差異顯著性。

3 結(jié)果

3.1 BPA暴露對成年小鼠恐懼記憶的影響

雙因素方差分析表明, BPA暴露×電擊交互作用(

F

(6,140) = 15.821,

p

<0.001)、主因素劑量(

F

(3,148) = 27.490,

p

<0.001)或電擊(

F

(2,149) =89.37,

p

<0.001)均極顯著影響小鼠的僵立時間。與電擊前相比, 正常小鼠在遭電擊后1 hr、24 hr的僵立時間均顯著延長(

p

<0.01,

p

<0.05), 表現(xiàn)出很強(qiáng)的場景性條件恐懼反應(yīng), 說明恐懼性條件反射成功建立。長期 BPA暴露促進(jìn)恐懼的形成和保持。與對照組相比, BPA (40 mg/kg/d)延長成年小鼠恐懼訓(xùn)練后1 hr和24 hr的僵立時間(

p

<0.01,

p

<0.05), 而BPA (4 mg/kg/d)顯著延長恐懼訓(xùn)練后1 hr的僵立時間(

p

<0.05), 表明成年小鼠長期暴露于BPA不僅提高恐懼記憶的獲得, 還可延長恐懼記憶的保持, 減緩恐懼記憶消退(圖1)。

圖1 長期BPA暴露對成年雄性小鼠條件恐懼訓(xùn)練后僵立時間的影響(M±SE, n = 10)

3.2 BPA暴露對海馬NMDA受體NR1亞基表達(dá)的影響

考慮到場景性條件恐懼記憶與海馬 NMDA受體的密切關(guān)系, 進(jìn)一步測定了小鼠恐懼訓(xùn)練前、后海馬NMDA受體NR1亞基的表達(dá)水平。雙因素方差分析表明, BPA暴露×電擊交互作用(

F

(6,60) =6.717,

p

<0.001)、劑量(

F

(3,68) = 4.978,

p

= 0.004)或電擊(

F

(2,69) = 66.093,

p

<0.001)主因素均極顯著影響小鼠海馬NR1表達(dá)。條件恐懼訓(xùn)練誘導(dǎo)海馬NR1表達(dá)水平升高, 特別是在恐懼訓(xùn)練后1 hr (

p

<0.05)。長期BPA (0.4, 4, 40 mg/kg/d)暴露顯著下調(diào)恐懼訓(xùn)練前海馬NR1的基礎(chǔ)表達(dá)水平(均為

p

<0.05), 卻促進(jìn)了條件恐懼訓(xùn)練對 NR1的誘導(dǎo)作用。與同一時間點(diǎn)的對照組相比, 恐懼訓(xùn)練后 1 hr和 24 hr的BPA (4, 40 mg/kg/d)暴露小鼠NR1表達(dá)水平均明顯升高(

p

<0.05), 表明成年期BPA暴露不僅影響海馬NR1基礎(chǔ)表達(dá), 也影響場景性條件恐懼形成及保持過程中NR1表達(dá)(圖2)。

圖2 長期 BPA暴露對成年雄性小鼠海馬腦區(qū) NMDA受體NR1亞基表達(dá)水平的影響(M±SE, n = 6)

3.3 BPA暴露對海馬組蛋白乙酰化水平的影響

組蛋白乙?；降奶岣弑徽J(rèn)為是場景性條件恐懼形成所必需的, 因此我們猜測 BPA對成年小鼠恐懼記憶的影響是否與組蛋白乙酰化水平的改變有關(guān)。與以往的報道一致(Levenson et al.,2004), 條件恐懼訓(xùn)練顯著提高海馬 H3K14水平(

p

<0.05), 降低HDAC2的表達(dá)(

p

<0.05)。BPA暴露×電擊交互作用(

F

(6,60) = 2.766,

p

= 0.019)、劑量(

F

(3,68) = 6.942,

p

<0.001)或電擊(

F

(2,69) = 44.130,

p

<0.001)主因素均極顯著影響海馬H3K14水平, 而電擊對HDAC2表達(dá)有極顯著影響(

F

(2,69) = 38.679,

p

<0.001)。恐懼訓(xùn)練前, 各組H3K14水平?jīng)]有明顯差異(圖 3), 但 BPA暴露小鼠的 HDAC2表達(dá)上調(diào)(

p

<0.05) (圖4)。與同一時間點(diǎn)的對照組相比, BPA(4和/或40 mg/kg/d)顯著上調(diào)恐懼訓(xùn)練后1 hr及24 hr 海馬 H3K14水平(

p

<0.05,

p

<0.05); 同時, 訓(xùn)練前因BPA (0.4、4、40 mg/kg/d)暴露增加的HDAC2表達(dá)在訓(xùn)練后1 hr及24 hr 被消除, 與訓(xùn)練前的同一處理組相比, 均表現(xiàn)出明顯降低(

p

<0.01,

p

<0.05)(圖3、4)。這些結(jié)果提示BPA提高組蛋白去乙?；傅幕A(chǔ)水平, 相反, 卻增加場景性條件恐懼形成和保持過程中的組蛋白乙?；?。

圖3 長期BPA暴露對成年雄性小鼠海馬腦區(qū)組氨酸H3乙?；?H3K14)表達(dá)水平的影響(M±SE, n = 6)

圖4 長期BPA暴露對成年雄性小鼠海馬腦區(qū)組氨酸去乙?；?(HDAC2)表達(dá)水平的影響(M±SE, n = 6)

3.4 BPA暴露對成年小鼠場景性條件恐懼誘導(dǎo)的ERK1/2活性的影響

ERK參與包括場景性條件恐懼在內(nèi)的海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶形成, 因此, 我們推測 ERKs信號通路可能介導(dǎo) BPA 對條件恐懼記憶的影響。雙因素方差分析結(jié)果表明, BPA暴露×電擊交互作用(

F

(6,60) = 2.42,

p

= 0.037)、劑量(

F

(3,68) = 4.336,

p

= 0.008)或電擊(

F

(2,69) = 16.533,

p

<0.001)主因素均顯著影響海馬ERK1/2 磷酸化(p-ERK1/2)水平。條件恐懼訓(xùn)練誘導(dǎo)海馬 p-ERK1/2表達(dá), 與恐懼訓(xùn)練前同一處理組相比, 無論是對照組還是 BPA暴露組訓(xùn)練后1 hr和24 hr的p-ERK1/2水平均顯著升高(

p

<0.05,

p

<0.01) (圖5)。90 d的BPA 暴露對成年雄性小鼠海馬ERK1/2及其p-ERK1/2表達(dá)均沒有明顯影響, 然而, BPA促進(jìn)了恐懼訓(xùn)練對ERK1/2的活化作用。與同一時間點(diǎn)對照組相比, BPA (4, 40 mg/kg/d)顯著增加小鼠恐懼訓(xùn)練后1 hr的p-ERK水平(

p

<0.05,

p

<0.01), 40 mg/kg/d BPA顯著上調(diào)訓(xùn)練后24 hr的p-ERK水平(

p

<0.05) (圖5)。這些結(jié)果表明, 條件恐懼訓(xùn)練增強(qiáng)海馬 ERK1/2磷酸化活性,而長期 BPA暴露對場景性條件恐懼訓(xùn)練誘導(dǎo)的ERK活化有促進(jìn)作用。

圖5 長期 BPA暴露對成年雄性小鼠海馬腦區(qū) ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)的影響(M±SE, n = 6)

4 討論

BPA作為一種廣泛存在的環(huán)境雌激素污染物,它的神經(jīng)發(fā)育毒性受到廣泛關(guān)注, 而 BPA對成年神經(jīng)系統(tǒng)的影響卻知之甚少。本研究首次發(fā)現(xiàn), 長期 BPA暴露可增強(qiáng)成年雄性小鼠恐懼記憶的獲得與保持, 并促進(jìn)條件恐懼訓(xùn)練誘導(dǎo)的海馬 NMDA受體亞基NR1表達(dá), H3K14水平升高和HDAC2水平降低; 同時, 恐懼訓(xùn)練誘導(dǎo)的ERK1 /2磷酸化進(jìn)一步增強(qiáng)。這些結(jié)果提示, 長期BPA暴露可能通過ERK信號通路介導(dǎo)海馬NMDA受體和/或組蛋白乙?；降奶岣叨鰪?qiáng)小鼠場景性條件恐懼記憶的形成和保持。

恐懼記憶是一種海馬依賴性的情感記憶, 其增強(qiáng)可導(dǎo)致恐懼情緒的形成(Morgan et al., 2001)。場景性條件恐懼模型常用于嚙齒類動物恐懼記憶獲得、保持和消退的研究, 而僵立反應(yīng)被認(rèn)為是反映恐懼的一個客觀指標(biāo)(Li et al., 2006)。本研究發(fā)現(xiàn),長期暴露于BPA (4和40 mg/kg/d)明顯延長成年雄性小鼠恐懼訓(xùn)練后1 hr和24 hr的僵立時間, 提示BPA可增強(qiáng)恐懼記憶的獲得與保持。與此相反, 我們以往的研究發(fā)現(xiàn)圍產(chǎn)期或青春期 BPA暴露損傷小鼠的空間和被動回避學(xué)習(xí)記憶(Xu, Zhang, Wang,Ye, & Luo, 2010; Xu, Tian, Hong, Chen, & Xie,2011); Eilam-Stock等也發(fā)現(xiàn)急性BPA暴露損傷成年雄性小鼠空間及視覺記憶(Eilam-Stock et al.,2012)。但本研究結(jié)果與最近日本學(xué)者的報道相一致, 他們發(fā)現(xiàn)圍生期暴露于 BPA可增強(qiáng)青年小鼠的恐懼記憶(Matsuda et al., 2013)。這些結(jié)果差異提示某種負(fù)性干預(yù)對負(fù)性情緒相關(guān)記憶的影響可能不同于對其它學(xué)習(xí)記憶功能的作用, 但這還需要進(jìn)一步的研究證據(jù)。恐懼被認(rèn)為與焦慮相關(guān)聯(lián), 焦慮癥患者臨床上出現(xiàn)過度焦慮的同時, 表現(xiàn)出恐懼和行為逃避等一系列癥狀; 而抗焦慮藥如氟辛克生(flesinoxan)可抑制恐懼記憶的獲得及保持(Burghardt, Sullivan, McEwen, Gorman, & LeDoux,2004)。因此, 場景性條件恐懼模型也廣泛用于焦慮機(jī)制的研究。值得注意的是, 本實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn), 生命早期 BPA暴露增強(qiáng)仔鼠成年后的焦慮情緒(Xu et al., 2012)。其他研究者也有類似報道。如,哺乳期 BPA暴露降低雄性仔鼠在高架十字迷宮開放臂的時間(Cox, Gatewood, Howeth, & Rissman,2010); 暴露于 BPA的新生大鼠成年后焦慮和攻擊行為增強(qiáng)(Patisaul & Bateman, 2008)。這些結(jié)果與本實(shí)驗中 BPA延長恐懼訓(xùn)練后的僵立時間所表現(xiàn)出的恐懼記憶增強(qiáng)相一致, 提示長期 BPA暴露增強(qiáng)雄性小鼠恐懼記憶, 加劇其焦慮樣情緒。

谷氨酸 NMDA受體是腦內(nèi)興奮性突觸后的必需組分, 與突觸可塑性密切相關(guān), 在學(xué)習(xí)記憶過程中起關(guān)鍵作用(Takahashi, Niimi, & Itakura, 2010;Sison & Gerlai, 2011)。同樣, NMDA受體也是條件恐懼記憶獲得和鞏固所必需(Pietersen et al., 2006)。本研究發(fā)現(xiàn), 雖然BPA 抑制海馬NMDA受體亞基NR1的基礎(chǔ)表達(dá)水平, 但BPA (4, 40 mg/kg/d)顯著促進(jìn)恐懼記憶形成和保持過程 NR1表達(dá)的上調(diào),表明長期 BPA暴露可以增加成年雄性小鼠海馬NMDA受體對行為訓(xùn)練刺激的敏感性, 并因此促進(jìn)條件恐懼記憶。

研究表明學(xué)習(xí)記憶過程發(fā)生表觀遺傳修飾, 組蛋白乙?；瞧渲幸环N重要方式。組蛋白乙?；?histone acetylase, HAT)促使組蛋白乙?；? 降低其與 DNA核酸骨架的結(jié)合能力, 使核小體結(jié)構(gòu)打開,促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄; 而組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)則通過組蛋白去乙?；饔靡种苹虻霓D(zhuǎn)錄(Kouzarides, 2007)。HAT與 HDAC相互拮抗, 使細(xì)胞內(nèi)的乙?；腿ヒ阴；幱趧討B(tài)平衡, 精確調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)(Choi & Howe,2009)。研究發(fā)現(xiàn), 神經(jīng)元的組蛋白乙酰化在學(xué)習(xí)記憶中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用, 場景性條件恐懼訓(xùn)練顯著上調(diào)海馬組蛋白 H3乙?；? 這一現(xiàn)象在恐懼訓(xùn)練后1 hr尤為顯著(Chwang et al., 2006; Levenson et al., 2004), 而組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉和曲古抑菌素 A可以促進(jìn)恐懼記憶(Guan et al., 2009;Gundersen & Blendy, 2009)。與這些研究結(jié)果相一致, 本研究發(fā)現(xiàn), 場景性條件恐懼訓(xùn)練顯著上調(diào)正常小鼠海馬腦區(qū)H3K14水平, 同時下調(diào)HDAC2表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)母體暴露于 BPA可改變仔鼠出生后 DNA甲基化狀態(tài)并因此影響特異基因表達(dá)(Kundakovic & Champagne, 2011), 而本研究發(fā)現(xiàn),長期BPA暴露可以改變成年小鼠海馬HDAC2的基礎(chǔ)表達(dá)水平, 表明BPA影響包括DNA甲基化和組蛋白乙?；缺碛^遺傳修飾的多種方式。此外, 本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn), 長期BPA (4和40 mg/kg/d)暴露還可促進(jìn)恐懼訓(xùn)練引起的 H3K14增加和 HDAC2降低, 提示組蛋白乙?；鰪?qiáng)可能是 BPA促進(jìn)恐懼記憶的一個原因。有人發(fā)現(xiàn), 神經(jīng)組織過表達(dá)HDAC2的轉(zhuǎn)基因小鼠空間記憶受損的同時, 樹突密度、突觸數(shù)目和神經(jīng)可塑性降低, 海馬CA1區(qū)高頻刺激誘導(dǎo)的長時程增強(qiáng)(LTP)減弱; 而敲除HDAC2則增加突觸數(shù)目和學(xué)習(xí)記憶能力, 并上調(diào)synaptophysin等一些參與神經(jīng)可塑性的突觸蛋白的基因表達(dá)(Guan et al., 2009)。因此, 推測長期BPA暴露可能促進(jìn)恐懼記憶誘導(dǎo)的組蛋白乙?；?后者增強(qiáng)相關(guān)腦區(qū)的突觸可塑性而最終影響恐懼記憶。

ERK/MAPK是腦內(nèi)參與突觸可塑性的重要信號通路。有報道海馬腦區(qū)ERK/MAPK的激活為聯(lián)想性記憶所必需(Athos, Impey, Pineda, Chen, &Storm, 2002)。與以往的報道一致, 本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)條件恐懼訓(xùn)練可明顯提高海馬腦區(qū)p-ERK1/2水平。長期BPA暴露不影響p-ERK1/2的基礎(chǔ)水平, 但促進(jìn)了恐懼訓(xùn)練后 p-ERK1/2表達(dá), 這一結(jié)果與恐懼記憶的增強(qiáng)、以及 NR1和組蛋白乙?；降纳呦嘁恢?。有研究發(fā)現(xiàn), 場景性條件恐懼上調(diào)海馬腦區(qū)組蛋白H3乙?；降淖饔靡蕾囉贜MDA受體和ERK1/2的活化, 海馬CA1區(qū)NMDA受體激活可增加組蛋白H3乙酰化, 該作用可因ERK信號通路的阻斷而抑制(Levenson et al., 2004)。NMDA受體的激活升高細(xì)胞內(nèi)Ca水平, 后者激活蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)和蛋白激酶 C (protein kinase C, PKC), 并經(jīng)一系列級聯(lián)反應(yīng)激活ERK1/2,一旦 ERK1/2被激活, 即轉(zhuǎn)到核內(nèi)調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化而改變基因表達(dá), 最終影響長時記憶的形成和鞏固(Chwang et al., 2006)。因此, 我們推測本研究發(fā)現(xiàn)的長期 BPA暴露促進(jìn)恐懼記憶的形成和保持可能通過ERK1/2信號通路增強(qiáng)海馬腦區(qū)組蛋白乙?；蕉M(jìn)行。值得注意的是, 長期BPA暴露下調(diào)條件恐懼訓(xùn)練前海馬NR1表達(dá)卻上調(diào)HDAC2表達(dá)的基礎(chǔ)水平, 但對 ERK1/2基礎(chǔ)值沒有影響, 提示與 BPA對條件恐懼訓(xùn)練后組蛋白乙?；挠绊憴C(jī)制不同, 長期BPA暴露對NMDA受體及組蛋白乙酰化基礎(chǔ)值的影響可能不依賴于ERK1/2的活化。

綜上所述, 長期暴露于 BPA可促進(jìn)成年雄性小鼠恐懼記憶的獲得和保持, 該作用可能與海馬組蛋白乙?；?NMDA受體水平的提高有關(guān), 而ERK1/2信號通路可能參與這一作用。恐懼記憶持續(xù)保持在較高水平可導(dǎo)致病理性恐懼的發(fā)生, 并引起焦慮和抑郁等情緒而損害人類的身心健康, 甚至有可能會導(dǎo)致精神疾病(吳冰 等, 2010)。近年來,焦慮癥、抑郁癥、恐懼癥等精神疾病的發(fā)病率呈上升趨勢, 推測除了重大創(chuàng)傷, 壓力等是造成精神疾病的因素外, 人們在生活中長期接觸 BPA也可能是一個不容忽視的原因。

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