謝啟應，鐘巧青，謝秀梅，楊天倫，陳美芳

血管緊張素Ⅱ通過上調白細胞介素-8受體表達增加單核細胞黏附*

謝啟應，鐘巧青△，謝秀梅，楊天倫，陳美芳

目的：探討血管緊張素II (Ang II）對單核細胞黏附的影響及機制研究。

方法： Ang II (10-6M） 培養(yǎng)人單核細胞株4 h或24 h，并加入氯沙坦 (1, 3, 10 μM）或抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，10 μM），檢測單核細胞內活性氧 (ROS）水平、單核內皮細胞黏附、上清液中白細胞介素-8 (IL-8）、腫瘤壞死因子α (TNF-α）水平、單核細胞的白細胞介素-8受體（CXCR2 ）mRNA表達以及核轉錄因子κB (NF-κB）和活化蛋白（AP-1） 的活性。

結果： Ang II (10-6M）孵育單核細胞后顯著增加細胞內ROS水平、上清液中白細胞介素-8和腫瘤壞死因子α水平，單核細胞內核轉錄因子κB和AP-1的活性以及上調CXCR2 mRNA表達，促進單核細胞黏附到內皮細胞。預先給予氯沙坦呈濃度依賴性的抑制Ang II誘導的上述反應，抗氧化劑PDTC同樣抑制Ang II誘導的氧化應激和單核細胞黏附。

結論：Ang II通過上調CXCR2表達，增加單核細胞黏附，活化單核細胞促進動脈粥樣硬化的發(fā)生，這一過程涉及ROS-NF-κB/AP-1通路。

血管緊張素II；單核細胞；白細胞介素-8；趨化因子受體

(Chinese Circulation Journal, 2014, 29: 367.)

單核細胞黏附到受損的內皮細胞繼而進入血管內膜下組織是動脈粥樣硬化早期發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。研究顯示白細胞介素-8（IL-8）屬于趨化因子（chemokine）CXC家族，其對單核細胞穩(wěn)定地黏附到內皮細胞起到重要作用。有研究報道不穩(wěn)定性心絞痛患者的白細胞介素-8水平明顯升高[1]；敲除白細胞介素-8的受體（CXCR2）后，斑塊病變和單核巨噬細胞的聚集均明顯減輕[2]。血管緊張素II（Ang II）是一種重要的致炎因子，它可誘導單核細胞增殖、游走，并促使單核細胞向巨噬細胞轉化。早期研究報道Ang II可上調CXC趨化因子表達，而使用CXCR2拮抗劑SB-517785-M幾乎可完全逆轉這一效應[3]。然而有關Ang II對單核細胞趨化因子的影響的相關研究報道少見，本實驗擬觀察Ang II對單核細胞黏附的影響及可能的分子機制。

1 材料與方法

材料：人單核細胞株（THP-1，ATCC）購自湘雅醫(yī)學院細胞培養(yǎng)中心。人臍靜脈血內皮細胞株（HUVEC-12，ATCC，CRL-2480）購自北京協(xié)和醫(yī)學院腫瘤研究所。Ang II、胰酶、抗氧化劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC）購自Sigma公司（圣路易斯，美國）；氯沙坦由美國默沙東公司饋贈；RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM系Gibco產品（加利福尼亞，美國）；小牛血清購自杭州四季青；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素8試劑盒購自上海森雄生物有限公司；RT試劑盒購自Fermentas（安大略省柏林頓，加拿大）；引物由上海生工技術有限公司合成。[γ-32P] ATP由北京福瑞生物工程公司提供；活性氧檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所，總RNA抽提試劑TRIzol、核轉錄因子κB （NF-κB）和活化蛋白（AP-1）探針，凝膠遷移系統(tǒng)購自Promega公司（麥迪遜，美國）。

人單核細胞的培養(yǎng)和處理：取THP-1細胞株，解凍復蘇后加入含15%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中置于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37℃）。1%血清處理24 h后將細胞密度調整為1×106個/ml接種于6孔培養(yǎng)板中，進行不同處理?？瞻讓φ战M：用含1%小牛血清的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育4 h或24 h；Ang II組：用含10-6M的Ang II的培養(yǎng)液孵育細胞4 h或24 h；氯沙坦（1, 3, 10 μM）組：1, 3, 10 μM的氯沙坦孵育1 h后加入10-6M的Ang II繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h；PDTC組：加入終濃度為10 μM的PDTC孵育1.5 h后加入10-6M的Ang II繼續(xù)培養(yǎng)4 h或24 h。

細胞內活性氧水平檢測[4]：將THP-1細胞接種于24孔板（104個/m l），孵育24～48 h待細胞融合經(jīng)1%血清處理后加入不同干預因素，然后進行實驗。在相應的時間點，棄去培養(yǎng)液，室溫下D-Hank’s液漂洗3次，加入10 μM H2DCF-DA熒光探針，37℃避光孵育20 min，D-Hank’s漂洗3次后加入1 m l 無血清的培養(yǎng)液，30 min后用熒光分光光度計測定熒光強度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為535 nm。

細胞黏附實驗 將THP-1細胞進行處理后加入6孔板未處理的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）中（每孔1 ml），37℃振蕩孵育30 min，用Hanks平衡液小心沖洗掉未粘附的單核細胞。用3%的多聚甲醛每孔200 μl固定，然后在倒置高倍顯微鏡下每孔隨機選擇6個視野（hpf）計數(shù)黏附的單核細胞數(shù)目。

白細胞介素-8、腫瘤壞死因子α含量的測定：嚴格按照試劑盒的要求[5]，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定白細胞介素-8、腫瘤壞死因子α，在含有抗體包被的96孔板，分別加入標準品和樣品各100 μl，37℃孵育 2 h，洗板 5 次，每孔加入 100 μl酶標二抗，37℃溫育1 h，洗板5次，加入底物100 μl，37℃閉光孵育15 min，每孔加入終止液1滴，用酶標儀在490 nm處測定吸光值，計算出白細胞介素-8的濃度?；蛴妹笜藘x在450 nm處測定吸光值，計算出腫瘤壞死因子α的濃度。

CXCR2 mRNA表達：采用Trizol法提取總RNA，取2 μg總RNA進行逆轉錄后取2 μl行多聚酶鏈反應（PCR）反應。CXCR2上游引物：5’-CGGAATTCAA ATGGAAGATTTTAACATGGAG-3’。下游引物：5’-CC GCTCGAGTTAGAGAGTAGTGGAAGTGTG-3’，擴增片段長度為417 bp。PCR反應體系20 μl，反應條件為94°C變性60 s，58°C退火60 s，72°C延伸60 s，38個循環(huán)。β-肌動蛋白（β-actin）上游引物：5’-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3’，下游引物：5’-ATGTCACGCACGATTTCC-3’，擴增片段長度為218 bp。PCR反應體系20 μl，反應條件為94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸60 s，28個循環(huán)。得到的多聚酶鏈反應產物2%的瓊脂糖電泳并用成像系統(tǒng)掃描攝片。

電泳遷移率改變檢測法（EMSA）分析核轉錄因子κB、AP-1活性 嚴格按照Promega公司提供的試劑盒說明書進行操作[6]。提取核蛋白用BCA法[7]檢測提取液中核蛋白濃度。核轉錄因子κB同序寡核苷酸探針序列為3’-TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G-5’；5’-AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C-3’。AP-1探針序列為5'-CGC TTG ATG AGT CAG CCG GAA-3'，3'- AAC TAC TCA GTC GGC CTT TGC-5'。采用T4寡核苷酸激酶法以[γ-32P] ATP （10 μCi/μl）進行末端同位素標記，游離探針用G-25層析法除去。蛋白 -DNA 結合反應在總容量 10 μl含有 8～10 μg核抽提物，4% glycerol，1 mM MgCl2，0.5 mM依地酸，0.5 mM DTT，50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl pH 7.5 和 1 μg poly（di-dc）的液體中于室溫下反應10 min。然后加入50 000～200 000 cpm標記探針入反應液中室溫下繼續(xù)孵育20 m in。在4%非變性聚丙烯酰胺電泳30 m in左右（電壓350 V，電泳緩沖液為0.5×TBE） 后干膠，置-70 ℃放射自顯影24 h。

統(tǒng)計學分析 用one-way ANOVA進行統(tǒng)計學處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，雙側P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 血管緊張素II對單核細胞黏附的影響（表1）

表1 血管緊張素II對單核細胞黏附的影響（n =4，±s）

表1 血管緊張素II對單核細胞黏附的影響（n =4，±s）

注：與空白對照組相比*P＜0.01；與血管緊張素Ⅱ組比△P＜0.01

組別 黏附的單核細胞數(shù) (高倍鏡)空白對照組 139 ± 20血管緊張素Ⅱ組 449 ± 38*氯沙坦組1 μM 238 ± 20△3 μM 201 ± 15△10 μM 192 ± 15△吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽組 242 ± 23△

Ang II培養(yǎng)單核細胞24 h ，Ang II組與空白對照組比，顯著增加黏附到內皮細胞上的單核細胞數(shù)（P＜0.01），與 Ang II組比較氯沙坦（1，3，10 μM）組、PDTC組可明顯減少黏附到內皮細胞上的單核細胞數(shù)（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義。

2.2 血管緊張素II對單核細胞CXCR2 mRNA表達的影響

Ang II刺激單核細胞4 h， Ang II組可上調CXCR2 mRNA表達（P＜0.01），氯沙坦（1，3，10 μM）組和PDTC組均可下調Ang II 誘導的CXCR2 mRNA表達（P＜0.01）。圖1

2.3 血管緊張素II對單核細胞培養(yǎng)上清液中白細胞介素-8、腫瘤壞死因子α水平的影響

Ang II培養(yǎng)單核細胞24 h ，Ang II組上清液中白細胞介素-8和腫瘤壞死因子α的含量與空白對照組比顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；氯沙坦（1, 3, 10 μM）組和PDTC組白細胞介素-8（圖2A）、腫瘤壞死因子α（圖2B）水平與Ang II組比含量降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05, P＜0.01）。

2.4 血管緊張素II對細胞內活性氧（ROS）水平的影響

Ang II培養(yǎng)單核細胞4 h，Ang II組較空白對照組顯著增加細胞內ROS生成，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。氯沙坦（1, 3, 10 μM）組和PDTC組ROS水平與Ang II組比顯著降低（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學意義（圖2C）。

2.5 血管緊張素II對單核細胞核轉錄因子κB和活化蛋白-1活性的影響

圖2 血管緊張素Ⅱ對上清液中白細胞介素-8（2A）、腫瘤壞死因子（2B）及細胞內活性氧（2C）生成的影響（n=6）

電泳遷移率改變檢測法（EMSA）結果所示，陰性對照組（沒有加任何核蛋白）沒有任何信號條帶顯影。與對照組相比，Ang II培養(yǎng)單核細胞4 h明顯增加核轉錄因子κB（圖3A）和AP-1（圖3B）的活性。氯沙坦（1, 3, 10 μM）組、PDTC組核轉錄因子κB和AP-1活性較Ang II組明顯降低。

圖3 電泳遷移率改變檢測法分析血管緊張素Ⅱ對單核細胞核轉錄因子κB（圖3A）和活化蛋白（圖3B）活性的影響（n=3）

3 討論

大量研究顯示Ang II通過誘導氧化應激，促進炎癥介質和趨化因子的釋放，促進單核細胞活化，參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。有研究報道，Ang II能增加還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性或表達促進ROS形成，增加斑塊的不穩(wěn)定性，促進動脈粥樣硬化的進展[8]。國內有研究報道Ang II可呈時間和濃度依賴性的增加內皮細胞超氧陰離子的生成，纈沙坦可阻斷Ang II的這一作用[9]，說明氧化應激在Ang II誘導的炎癥反應過程中起著非常重要的作用。

單核細胞遷移黏附到血管內皮的過程中趨化因子起了至關重要的作用。研究顯示，白細胞介素-8可趨化新鮮分離的外周血單核細胞，促進單核細胞在流動的條件下穩(wěn)定地黏附于血管內皮。CXCR2受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體，與白細胞介素-8結合可幫助單核細胞穩(wěn)定黏附到內皮細胞。研究報道，冠心病患者外周血CXCR2表達上調[10]；在動脈粥樣硬化進展期的粥樣斑塊巨噬細胞富集區(qū)CXCR2明顯表達，敲除CXCR2受體后，斑塊病變和單核巨噬細胞的聚集均明顯減輕[2]。在佛波醇誘導的人單核細胞株細胞，氯沙坦可抑制Ang II誘導的細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子表達上調[11]。在體研究報道，大鼠腹腔注射Ang II可顯著增加CXC趨化因子的水平，上調CXCR2的mRNA表達，增加中性粒細胞和單核細胞募集，而給予CXCR2阻斷劑SB517785-M可抑制這一過程[12]。本實驗結果顯示Ang II能顯著增加單核細胞內ROS生成，增加下游炎癥因子白細胞介素-8、腫瘤壞死因子α，上調趨化因子受體CXCR2誘導單核細胞黏附，預先給予氯沙坦或PDTC可阻斷Ang II的作用，提示Ang II通過其受體誘導的氧化應激介導了單核細胞黏附，這一過程與激活IL-8/CXCR2系統(tǒng)有關。

到目前為止，Ang II誘導趨化因子和炎癥因子表達的信號傳導途徑尚不明確。然而，有越來越多的證據(jù)支持核轉錄因子κB和AP-1可能協(xié)同參與這一過程。研究報道各種炎癥刺激包括Ang II、脂多糖、促炎細胞因子、氧自由基、病毒等都能活化AP-1；Ang II通過活化核轉錄因子κB通路，從而誘導大量炎癥基因如白細胞介素-8、腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β的轉錄[13]。Schmeisser等[14]報道Ang II增加單核細胞白細胞介素-8的表達，氯沙坦可通過降低核轉錄因子κB活性阻斷Ang II 的作用。本研究發(fā)現(xiàn)Ang II通過誘導氧化應激，激活核轉錄因子κB和AP-1，誘導單核細胞黏附，而氯沙坦或抗氧化劑PDTC可抑制這一過程，提示Ang II通過激活ROS-NF-κB/AP-1信號通路上調白細胞介素8/CXCR2表達，誘導單核細胞黏附。氯沙坦通過其抗氧化和抗炎癥特性抑制Ang II所致的單核細胞活化，這也可能是氯沙坦新的抗動脈粥樣硬化的新機制之一，值得進一步深入探討。

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（編輯：常文靜）

Angiotensin Ⅱ Increasing the Monocyte Adhesion Via Up-regulating IL-8 Receptor CXCR2 Expression

XIE Qi-ying, ZHONG Qiao-qing, XIE Xiu-mei, YANG Tian-lun, CHEN Mei-fang.
Department of Geriatric Medicine, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha (410008), Hunan, China

CHEN Mei-fang, Email: meifang121@sohu.com

Objective: To explore the effect of angiotensin II (Ang II) increasing the monocyte adhesion w ith the possible molecular mechanism.

Methods: The experimental human monocytoid cells (THP-1) were cultured in 4 groups, each group contained 1×106cells. ① Blank control group, the cells were cultured for 4h or 24 h. ② Ang II treated group, the cells were cultured w ith Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. ③Losartan treated group, the cells were cultured w ith losartan (1, 3, 10)μM for 1 hour and followed-by Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. ④ PDTC group, cells were cultured w ith the anti oxidative agent PDTC 10 μM for 1.5 h and followed by Ang II (10-6M) for 4h or 24 h. The intracellular reactive oxygen species(ROS), the levels of interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor (TNF-α) in the medium and the adhesion of monocyte to endothelial cells were exam ined. The expression of CXCR2 mRNA, nuclear factor kappaB (NF-κB) activity and activated protein (AP-1) were determ ined and compared among different groups.

Results: Compared w ith Blank control group, the Ang II treated group had signifi cantly elevated intracellular ROS,IL-8 and TNF-α, more monocyte adhesion to endothelial cells, higher expression of CXCR2 mRNA, increased activity of NF-κB and AP-1. The above Ang II induced up-regulations were inhibited by losartan in a dose-dependent manner. PDTC may also inhibit the Ang II induced oxidative stress and monocyte adhesion.

Conclusion: Ang II activates monocyte for developing atherosclerosis via up-regulating IL-8 receptor CXCR2 expression, which m ight be involved in ROS-NF-κB/AP-1 pathway.

Angiotensin II; Monocyte; Interleukin-8; Chemokine receptor

省科技廳課題（編號：2008FJ4183）；湖南省衛(wèi)生廳課題（編號：B2010-013）

410008 湖南省長沙市，中南大學湘雅醫(yī)院 老干科（謝啟應、謝秀梅、楊天倫、陳美芳）；4230003 湖南省，郴州市第一人民醫(yī)院心內科（鐘巧青）

謝啟應 副教授 博士 主要從事心臟電生理研究 Email： eagledoctor@163.com△鐘巧青為并列第一作者 通訊作者：陳美芳Email： meifang121@sohu.com

R54

A

1000-3614（2014）05-0367-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.05.013

2013-09-13）