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      他克莫司微生物合成的研究進展

      2014-02-05 02:38:06萬濤黃笛聞建平
      化學(xué)工業(yè)與工程 2014年4期
      關(guān)鍵詞:輔酶克莫司前體

      萬濤,黃笛,聞建平

      (天津大學(xué)化工學(xué)院,系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室,天津300072)

      他克莫司(Tacrolimus,F(xiàn)K-506)是由筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風(fēng)、Nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療[1]。他克莫司商品名為Protopic,于1994年被美國食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市,是治療特異性皮炎早期緩解和長期控制的非甾體類藥物[2],目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng),治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實體器官移植術(shù)后應(yīng)用其他免疫抑制藥物無法控制的移植物排斥反應(yīng)。由于在臨床效果免疫抑制作用比環(huán)孢素A強10~100倍,因而大大降低了臨床使用劑量,同時不良反應(yīng)也明顯降低。他克莫司市場大部分被歐美國家占領(lǐng),開發(fā)具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的他克莫司生產(chǎn)技術(shù)十分必要。

      本論文主要對他克莫司的理化特征和免疫抑制活性、他克莫司微生物發(fā)酵、合成基因簇的研究成果和前體代謝工程的研究狀況進行了綜述,同時結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)對他克莫司的生產(chǎn)及其基因組尺度代謝工程改造進行了展望。

      1 他克莫司的理化特征和免疫抑制活性

      他克莫司是從鏈霉菌屬(Streptomyces)中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物,包括 Streptomyces tsukubaensis,Streptomyces tacrolim icus,Streptomyces sp.ATCC 53770,Streptomyces sp.MA6949,Streptomyces kanamyceticus KCC-S0436,Streptomyces glaucescens,Streptomyces clavuligerus CKD1119。他克莫司是一種很有效的23元大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑,分子式是 C44H69NO12,相對分子質(zhì)量為804.02,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1,在常溫下為無色晶體,難溶于水,易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿和丙酮等有機溶劑。熔點為127~129℃,在不同貯存條件下穩(wěn)定性都較高[2]。

      圖1 他克莫司(FK 506)分子式Fig.1 Form u la of Tacrolim us(FK 506)

      研究發(fā)現(xiàn),他克莫司可以有效抑制T淋巴細胞的誘導(dǎo)作用,能夠抑制淋巴因子 IL-2,IL-3,IFN-Y的產(chǎn)生和IL-2受體的表達,同時他克莫司抑制了ConA活性和相同抗原誘導(dǎo)的淋巴細胞活化,以及淋巴細胞的增殖反應(yīng)[3]。體內(nèi)實驗也證明他克莫司在免疫抑制方面有良好表現(xiàn),它可以延長大鼠及狗的心臟、肝臟、腎臟和肢體等抑制器官的存活期,雖然抑制效果與與藥物濃度存在相關(guān)性,但藥物劑量過大會產(chǎn)生一定的副作用。小劑量的環(huán)孢霉素或強的松在與他克莫司共同使用時,可以降低他克莫司的用量,從而減弱其產(chǎn)生的毒性,進而增強其免疫抑制作用。臨床發(fā)現(xiàn),他克莫司能夠明顯減少腎臟移植后出現(xiàn)的急慢性排斥反應(yīng)發(fā)病率,改善手術(shù)后腎臟的功能,并且降低高血脂和高血壓等病癥的發(fā)生率[3]。除此之外,他克莫司還被證實具有很好的抑制炎癥作用[4],以及抑制人的肺肥大細胞或嗜堿性細胞的組胺或LTC4等炎癥介質(zhì)的釋放。多種炎癥性皮膚病的炎癥介質(zhì)為組胺和前列腺素D2,小劑量他克莫司可以抑制免疫球蛋白E激活人體皮膚肥大細胞釋放組胺和前列腺素D2。

      2 他克莫司的微生物發(fā)酵生產(chǎn)

      由于他克莫司的重要醫(yī)用價值,很多人嘗試著用培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高他克莫司的產(chǎn)量。1984年,日本藤澤公司研究所從日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌的發(fā)酵液中提取得到他克莫司的發(fā)酵產(chǎn)率很低,優(yōu)化發(fā)酵條件之后,產(chǎn)率提高了10倍多。之后,進行了菌株的改良和發(fā)酵條件的進一步優(yōu)化,生產(chǎn)能力提高了幾十倍。1991年,Merck公司對菌株經(jīng)過優(yōu)化后,他克莫司7 d達到37.8 mg/L。Kumar等[5]從土壤中篩選出一株鏈霉菌,他克莫司產(chǎn)量較高而且副產(chǎn)物極少,誘變后發(fā)酵300 h他克莫司產(chǎn)量最高為5~10 mg/L,該研究組之后在高通氣量的糊精培養(yǎng)基中通過補料分批發(fā)酵192~279 h,產(chǎn)量達到 300 ~310 mg/L[6]。

      Yoon等[7]研究了初始培養(yǎng)基中添加磷酸鹽、銨鹽和氨基酸等對菌種合成他克莫司的影響,發(fā)現(xiàn)銨離子的添加雖然可以刺激菌絲生長、提高葡萄糖和磷酸鹽吸收速率,但是對他克莫司合成具有阻遏作用,最終利用30 mmol/L的亮氨酸和24.5 mmol/L的乳酸為初始碳源,將他克莫司的產(chǎn)量由12.7 mg/L提高到了18.2 mg/L。Kim等[8]通過向初始培養(yǎng)基中添加3 g/L玉米油,發(fā)酵8 d將他克莫司的產(chǎn)量由145 mg/L提高到了235 mg/L。該研究還考察了他克莫司發(fā)酵過程中脂肪酶的酶活性變化,指出該酶在玉米油的誘導(dǎo)下合成,并且在添加葡萄糖后明顯被抑制,證實脂肪酶與他克莫司發(fā)酵單位成正相關(guān),暗示高的脂肪酶活性成為他克莫司合成過程中的重要因子,同時也證明了油脂作為前體的重要性。他們通過在200 L發(fā)酵罐放大后最高產(chǎn)量達到495 mg/L,比生產(chǎn)單位也達到0.34 g/g菌體干重。Singh等[9]研究了外源添加花生油、大豆油、棉籽油和氨基酸對于菌種Streptomyces spp.MA6858 B3178合成他克莫司的影響,外源添加30 g/L大豆油和0.2 g/L的賴氨酸,發(fā)酵5 d時產(chǎn)量由85.8 mg/L提高到103.1 mg/L。同時,該研究還得出他克莫司在不同碳源發(fā)酵條件下呈現(xiàn)雙階段行為---在開始24 h單糖主要用來合成菌體,36 h后豆油和賴氨酸添加不僅維持菌體生長,還提高了產(chǎn)物生成,并且培養(yǎng)基pH值起到關(guān)鍵作用。Jung等[10]通過逐漸提高培養(yǎng)基中他克莫司的濃度(600~1 600 mg/L)來增加菌株對產(chǎn)物的耐受性,最終獲得的菌株產(chǎn)量達到972 mg/L。

      目前,國內(nèi)研究他克莫司主要圍繞自然篩選,原始菌株誘變篩選,優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵操作條件等。李玲等[11]采用抑菌圈法初篩得到71株能抑制白色假絲酵母生長的菌株,高效液相色譜法檢測代謝產(chǎn)物復(fù)篩,獲得一株他克莫司產(chǎn)生菌株。王秀琴等[12]采用通過復(fù)合誘變的方法對出發(fā)菌株筑波鏈霉菌08-6-9進行處理,得到一株高產(chǎn)菌株,其搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高73.6%。鄭軍榮等[13]應(yīng)用化學(xué)和物理誘變劑對他克莫司產(chǎn)生菌進行菌種誘變,并利用特定的選擇劑(莽草酸和哌可酸及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物)作為選擇壓力篩選出高產(chǎn)突變株,相對發(fā)酵效價比出發(fā)菌株提高了約2倍。劉忠[14]通過正交試驗優(yōu)化了他克莫司產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基,考察了不同的發(fā)酵條件對他克莫司合成的影響,研究發(fā)現(xiàn),在5 m3發(fā)酵罐上發(fā)酵144 h他克莫司的的產(chǎn)量可以達到330 mg/L。

      3 他克莫司合成基因簇及其代謝途徑

      他克莫司結(jié)構(gòu)復(fù)雜,內(nèi)酯環(huán)由5個甲基丙二酰、2個丙二酰、2個甲氧基丙二酰和1個烯丙基丙二酰延伸單元組成,環(huán)外的環(huán)己烷來自分支酸,哌可酸來自賴氨酸,甲氧基來自甲硫氨酸。目前,他克莫司生物合成基因簇基因產(chǎn)物的功能已基本得到闡明[15-17],他克莫司總的合成過程如圖 2所示,由聚酮合酶(PKS)開始聚合前體物,PKS包括 3個部分---FkbB負責(zé)分支酸衍生物4,5-二羥基-1-烯基環(huán)己烷羧酸(DHCHC)以及4個延伸單位(2個甲基丙二酰輔酶A,1個丙二酰輔酶A,1個烯丙基丙二酰輔酶A)的連接和縮化;FkbC有2個延伸單位(2個甲基丙二酰輔酶A);FkbA有2個延伸單位(2個甲氧基丙二酰輔酶 A,1個甲基丙二酰輔酶 A,1個丙二酰輔酶A)。每個延伸單元伴隨特別的β-酮基延伸步驟,聚酮鏈也對應(yīng)增長。FkbA、FkbB和FkbC組成了I型PKS系統(tǒng),每個模塊單元包含了幾個酶結(jié)構(gòu)體:酮酰合酶(KS),?;D(zhuǎn)移酶(AT),?;d體蛋白(ACP),他們用于鏈延伸,同時部分含有脫水酶(DH),烯酰還原酶(ER),酮基還原酶(KR)(圖2)。PKS合成的中間體與FkbP肽合酶催化的哌克酸縮合、成環(huán)。在PKS復(fù)合體釋放后,13元環(huán)進入后修飾過程,C9位被FkbD氧化成酮基官能團,C31位被 FkbM甲基化(圖2)。當(dāng) C21位 R官能團為甲基,即他克莫司插入的烯丙基丙二酰輔酶A被乙基丙二酰輔酶A替換時生成產(chǎn)物為子囊霉素(FK520)。當(dāng)C21位R官能團雙鍵被加氫,則產(chǎn)物為雙氫他克莫司(FK506D)。

      他克莫司生物合成基因簇已經(jīng)被測序并從實驗證實了各個基因所具有的功能,其中,fkbA、fkbB和fkbC負責(zé)延伸單元的連接和縮化,形成內(nèi)酯環(huán);fkbL負責(zé)哌可酸的生物合成;fkbP負責(zé)哌可酸與內(nèi)酯環(huán)連接;tcsA、tcsB、tcsC和 tcsD負責(zé)烯丙基丙二酰輔酶A的生物合成;fkbD負責(zé)他克莫司C9的羥基化、氧化,產(chǎn)生 β-羰基酰胺,fkbM負責(zé) C31的羥基甲基化;fkbG、fkbH、fkb I、fkbJ和 fkbK負責(zé)甲氧基丙二酰輔酶A的合成;合成起始單元DHCHC是從由分支酸經(jīng)過fkbO轉(zhuǎn)化而來[18](圖3)。他克莫司的生物合成過程是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程,要求一個高效的調(diào)控機制來保證初級代謝的前體供應(yīng),以及在PKS上的結(jié)合與催化和PKS的后修飾過程。除參與合成的必需基因外,在基因簇的兩端還發(fā)現(xiàn)幾個ORF。通過基因序列相似性分析,發(fā)現(xiàn) tcs2、tcs7、fkbN編碼的蛋白分別與AsnC、LysR、LAL家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序列高度一致,推測可能起調(diào)控作用。Mo等[19]通過基因過表達、敲除與回補實驗,發(fā)現(xiàn) tcs2對他克莫司的合成不起作用,敲除或者過表達后都沒有影響產(chǎn)量;tcs7起負調(diào)控作用,敲除后他克莫司和副產(chǎn)物子囊霉素產(chǎn)量提高了1.9和1.7倍;fkbN起正調(diào)控作用,調(diào)控因子對他克莫司的合成是必需的,敲除后菌株失去合成能力。

      4 他克莫司菌株代謝工程

      4.1 他克莫司前體代謝工程改造及競爭途徑敲除

      圖2 他克莫司PKS和生物合成結(jié)構(gòu)類似物過程[16]Fig.2 Schem atic rep resen tation of the PKS and biosynthesis of tacrolim us and its derivatives[16]

      圖3 他克莫司生物合成基因簇[16]Fig.3 O rganization of tacrolim us's biosynthetic gene clusters[16]

      在前面的介紹中提到,他克莫司由10個輔酶A縮合而成,因此提高這些輔酶A前體的合成水平可以直接提高他克莫司的產(chǎn)量。其中,甲基丙二酰輔酶A合成途徑有4條:由甲基丙二酰輔酶A變位酶催化的琥珀酰輔酶A異構(gòu)化;通過丙酰輔酶A羧化酶對丙酰輔酶A的羧化反應(yīng)實現(xiàn);來自纈氨酸代謝產(chǎn)生的異丁酰輔酶A的多步氧化;丙二酰輔酶A/甲基丙二酰輔酶A連接酶途徑。為了提高前體甲基丙二酰輔酶A的胞內(nèi)水平,Mo等[20]研究發(fā)現(xiàn),對原始菌株表達異源基因甲基丙二酰輔酶A連接酶和差向異構(gòu)酶,丙酰輔酶 A羧化酶和丙酰輔酶 A合酶,他克莫司水平并沒有提高,但是在過表達甲基丙二酰輔酶A變位酶后胞內(nèi)甲基丙二酰輔酶A和他克莫司濃度分別提高3.0和1.5倍。Chen等[15]對他克莫司合成的2個稀有前體烯丙基丙二酰輔酶A和甲氧基丙二酰輔酶A合成途徑分別過表達,發(fā)現(xiàn)他克莫司從46.9 mg/L分別提高到95.7和61.3 mg/L,分別提高了100%和30%。在同一株菌株過表達兩個途徑后產(chǎn)量提高到105.9 mg/L,提高了接近125%。

      4.2 系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下的他克莫司目標(biāo)基因改造

      由于他克莫司前體較多,通過多條途徑合成,主要涉及到糖代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝,受到細胞內(nèi)還原力、能量供應(yīng)的制約,而且涉及到胞內(nèi)調(diào)控基因的時序性表達,而單純的基因工程操作存在不確定性高、且通常只考慮單一的代謝途徑,包含整個細胞內(nèi)所有的基因-蛋白-反應(yīng)關(guān)系也只是從化學(xué)計量角度分析,不能體現(xiàn)細胞基因所有調(diào)控功能以及反映出的真實動態(tài)胞內(nèi)代謝特性和生物性狀,對于實現(xiàn)微生物生理代謝功能的理性全局性調(diào)控水平很有限,很難找到目標(biāo)基因以及更深層次的目標(biāo)酶/酶系研究,因此開展他克莫司產(chǎn)生菌基因組尺度動態(tài)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析進而改造目的基因、目標(biāo)酶/酶系顯得尤為重要。

      隨著基因組測序為代表的大規(guī)模數(shù)據(jù)產(chǎn)出,傳統(tǒng)的生物學(xué)研究方式正在發(fā)生改變,在基因組測序和注釋海量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上,基因組尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)迅速發(fā)展起來[21]。基因組尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為研究微生物代謝系統(tǒng)不可缺少的工具[22-23],在設(shè)計代謝工程經(jīng)典途徑、代謝物合成、代謝通量分析、不同物種代謝途徑之間的進化分析、挖掘組學(xué)數(shù)據(jù)信息以及選擇酶工程靶標(biāo)物方面都具有重要的應(yīng)用[24]。 本課題組[25]對目標(biāo)產(chǎn)物他克莫司采用了基于基因組尺度擬穩(wěn)態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建,并通過穩(wěn)態(tài)代謝通量分析,OptKnock敲除模擬準(zhǔn)確預(yù)測出能提高菌株他克莫司產(chǎn)量的目標(biāo)基因,確定對他克莫司生物合成重要的關(guān)鍵酶;通過分子改造實驗驗證了模型預(yù)測,構(gòu)建代謝工程菌株產(chǎn)量由150 mg/L提高到450 mg/L。

      5 結(jié)語

      目前,對他克莫司的生物合成研究正在朝著多尺度、系統(tǒng)化、合成生物學(xué)的方向發(fā)展。對模式微生物(如天藍色鏈霉菌)的代謝網(wǎng)絡(luò)、基因調(diào)控的深入研究,為研究筑波鏈霉菌提高他克莫司產(chǎn)量提供了借鑒意義;隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展,動態(tài)分析他克莫司的合成及調(diào)控途徑,使菌株合成基因能適時表達成為可能。

      1)對他克莫司生產(chǎn)菌的研究應(yīng)采用系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)手段,以整個細胞網(wǎng)絡(luò)作為優(yōu)化目標(biāo),利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組分析,在基因組規(guī)模上做動態(tài)分析菌體合成能力將對遺傳調(diào)控信號和環(huán)境擾動的響應(yīng),將有利于揭示菌體的遺傳機理,也將深入理解他克莫司生物合成的調(diào)控機制,如:轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控、反饋抑制和代謝流的分布,實現(xiàn)在菌體細胞內(nèi)調(diào)控元件之間的優(yōu)化磨合對接,極大地提升模型預(yù)測的能動性和精確度,篩選出關(guān)鍵限速節(jié)點,為已有的他克莫司產(chǎn)生菌進一步進行代謝工程改造提供指導(dǎo)。

      2)對他克莫司關(guān)鍵基因的合成生物學(xué)研究為開發(fā)具有更優(yōu)性質(zhì)的合成基因指明了方向。合成生物學(xué)倡導(dǎo)將不同的代謝途徑組成“模塊”,各“模塊”之間按照統(tǒng)一的“接口”進行連接并表達相應(yīng)的新途徑。他克莫司合成機制的闡明及基因組序列的公布,為合成高效前體途徑關(guān)鍵酶提供了新的有效突破口,從而理性重構(gòu)合成途徑,使菌株最高效地合成目的產(chǎn)物。隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展,采用全新酶的模擬優(yōu)化對接進行全新設(shè)計、改造及優(yōu)化,在不久的將來,可以根據(jù)目的不同構(gòu)建全新高效的關(guān)鍵酶。

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