馬強(qiáng)強(qiáng)，趙廣榮

(天津大學(xué) 化工學(xué)院制藥工程系 系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津300072)

左旋多巴(L-DOPA)化學(xué)名為 β-3，4-二羥苯基-α-丙氨酸(3，4-2dihydroxylphenylalanine)(圖 1)，又名3-羥基-L-酪氨酸。其作用機(jī)理為左旋多巴能通過血腦屏障，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在脫羧酶的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?，進(jìn)而發(fā)揮治療帕金森綜合癥的作用［1］。目前左旋多巴的制備方法主要有化學(xué)合成，植物提取，生物酶催化以及微生物發(fā)酵。由于化學(xué)合成和植物提取方法具有一定的局限性。20世紀(jì)60年代末，國內(nèi)外一些學(xué)者開始探索生物酶法合成左旋多巴。左旋多巴的生物合成常用的酶有兩種，其一是酪氨酸酚解酶［2］，以鄰苯二酚、丙酮酸和氨水為底物，催化形成;另外一種是一種羥化酶［3］，在酪氨酸的臨位羥基上直接羥化，形成左旋多巴。

圖1 左旋多巴Fig.1 L-DOPA

林可鏈霉菌中l(wèi)mbB2基因編碼的蛋白(LmbB2)具有酪氨酸酶的功能［4］，可催化L-酪氨酸生成左旋多巴。本研究是以林可鏈霉菌的lmbB2為目的基因，連入pCDFDuet-1載體中，構(gòu)建了表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，合成了左旋多巴。并通過添加底物以及L-抗壞血酸，以提高左旋多巴的產(chǎn)量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Streptomyces lincolnensis，大腸桿菌 Escherichia coli DH5a，E.coli BL21(DE3)，本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pCDFDuet-1購于 Novagen公司;pEASY-T3載體購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;左旋多巴購于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司;酪氨酸購于上海生工生物工程有限公司。

1.2 載體構(gòu)建

在MS固體培養(yǎng)基上活化林可鏈霉菌，轉(zhuǎn)接在YEME培養(yǎng)基中，36 h后收獲菌絲體。根據(jù)鏈霉菌遺傳操作手冊(cè)［5］，采用Kriby-mix方法提取鏈霉菌基因組DNA。利用引物lmbB2-F:GCCGGAATTCGATGAGTTCACTCGAGGCACGC(下劃線為 Eco RI酶切位點(diǎn))，lmbB2-R:GCCCAAGCTTAGCACTGCCTGACCAGGCT(下劃線為Hin dⅢ酶切位點(diǎn))，擴(kuò)增目的基因。TA克隆，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，測序。

從測序正確克隆菌中提取質(zhì)粒，用 Eco RI和Hin dⅢ雙酶切，回收片段連接到雙酶切的載體pCDFDuet-1中，獲得 pCDF-lmbB2表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)感受態(tài)。

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

在M9培養(yǎng)基中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的甘油，37 ℃，220 r/min，培養(yǎng) BL21(DE3)/pCDF-lmbB2重組菌。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5，添加異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，終濃度為1 mmol/L。每4 h測定 OD600，取樣1 m L。樣品10 000 r/min離心5 min，取上清用0.22μm濾膜過濾，用HPLC檢測左旋多巴含量。

1.4 左旋多巴的測定

使用Agilent 6310型HPLC，二極管陣列檢測器(DAD)，流動(dòng)相為乙腈/0.08%甲酸為2.4/97.6，色譜柱 C18 柱(250 ×4.0，particle size，5 μm)，柱溫30℃，檢測波長280 nm，流動(dòng)相流速1 mL/min，進(jìn)樣體積10μL。

1.5 酪氨酸的添加對(duì)發(fā)酵的影響

酪氨酸在水中的溶解度低，為了研究酪氨酸對(duì)發(fā)酵的影響，選定培養(yǎng)基中酪氨酸濃度分別為100、200、300、400 mg/L。 菌體培養(yǎng)至 OD600≈0.5，添加IPTG誘導(dǎo)，終濃度為1 mmol/L。

1.6 L-抗壞血酸對(duì)發(fā)酵的影響

M9培養(yǎng)基，添加0.4%甘油，酪氨酸300 mg/L。添加抗壞血酸的終濃度分別成為 100、1 000、3 000 mg/L。菌體培養(yǎng)至OD600≈0.5，添加 IPTG誘導(dǎo)，終濃度為1 mmol/L。

2 結(jié)果

2.1 lmbB2基因表達(dá)載體構(gòu)建與表達(dá)

林可鏈霉菌lmbB2基因的編碼區(qū)長度954 bp，編碼產(chǎn)物L(fēng)mbB2的理論大小為31 KD。由于該基因3’-端連續(xù)GC，不能有效擴(kuò)增。為此在終止密碼下游204 bp處設(shè)計(jì)了反向引物，PCR擴(kuò)增整個(gè)片段大小為1 177 bp。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳如圖2。連接到pEASY-T3載體上，經(jīng)過酶切、測序鑒定，獲得了lmbB2基因。進(jìn)一步與pCDFDuet-1酶切連接，構(gòu)建了pCDF-lmbB2表達(dá)載體(圖3)，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，獲得了工程菌株。

圖2 lmbB2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Gel electrophoresis of PCR p roduct of lm bB2

圖3 pCDF-lm bB2表達(dá)載體的酶切電泳圖Fig.3 Gel electrophoresis of EcoRI/H ind II digestion of pCDF-lm bB2

IPGT誘導(dǎo)工程菌株后，LmbB2的蛋白質(zhì)電泳如圖4。LmbB2蛋白集中在上清部分，表明 lmbB2是可溶性表達(dá)。

圖4 重組菌表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of E.coli L21(DE3)/pCDF-lm bB2

2.2 重組菌合成左旋多巴的能力

用M9培養(yǎng)基，IPTG誘導(dǎo)后連續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)36 h，生長曲線如圖5。重組菌和對(duì)照菌(無 lmbB2基因)的生長沒有明顯差異，表明外源基因 lmbB2對(duì)菌體生長無顯著影響。左旋多巴生成曲線如圖6。發(fā)酵4 h就檢測到左旋多巴的合成，到16 h時(shí)左旋多巴的產(chǎn)量達(dá)到最大，為 37 mg/L，隨后產(chǎn)量下降。

圖5 重組菌的生長曲線Fig.5 G row th curve of the recom bination strains

圖6 發(fā)酵過程中左旋多巴的含量Fig.6 Concentration of L-DOPA in ferm entation p rocess

2.3 底物酪氨酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響

酪氨酸是LmbB2催化的底物，直接影響左旋多巴產(chǎn)量。添加酪氨酸后，重組菌的生長速度明顯變慢(如圖7)，左旋多巴的產(chǎn)量大大增加(圖8)。當(dāng)添加酪氨酸300 mg/L時(shí)，發(fā)酵32 h，發(fā)酵液中左旋多巴產(chǎn)量最高，為122 mg/L，與未添加組(15 mg/L)相比，提高了8倍，酪氨酸的轉(zhuǎn)化率為40.67%。

圖7 添加不同濃度L-酪氨酸對(duì)重組菌細(xì)胞生長的影響Fig.7 Effects of concentration of L-tyrosine on cell grow th

圖8 添加不同濃度酪氨酸對(duì)左旋多巴的產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of concentration of L-tyrosine on yield of L-DOPA

2.4 L-抗壞血酸對(duì)左旋多巴合成的影響

在發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)左旋多巴的減少，伴隨著培養(yǎng)液顏色變黑，可能左旋多巴被進(jìn)一步氧化或聚合［6］。為此，添加還原劑抗壞血酸，左旋多巴的產(chǎn)量顯著增強(qiáng)(圖9)，而對(duì)大腸桿菌的生長影響不明顯(圖10)。添加3 g/L抗壞血酸，發(fā)酵32 h時(shí)，左旋多巴的產(chǎn)量最大，達(dá)285 mg/L，酪氨酸的轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。

3 討論

圖9 添加不同濃度抗壞血酸對(duì)左旋多巴產(chǎn)量的影響Fig.9 Effects of concentration of L-ascorbic acid on yield of L-DOPA

圖10 添加不同濃度L-抗壞血酸時(shí)重組菌的生物量Fig.10 Effects of concentration of L-ascorbic acid on cell grow th

酪氨酸酶通常同時(shí)具有單酚氧化酶和二酚氧化酶活性，其中單酚氧化酶催化單酚羥基化，二酚氧化酶可將二酚類化合物氧化為醌類化合物。左旋多巴不穩(wěn)定，在有氧條件下可自發(fā)氧化為多巴醌［7］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LmbB2可催化 L-酪氨酸轉(zhuǎn)為左旋多巴，同時(shí)繼續(xù)氧化多巴生成多巴醌，使培養(yǎng)液呈現(xiàn)黑色。為防止左旋多巴的氧化，可以加入還原劑。李華鐘等［8］報(bào)道，以磷酸吡哆醛為輔酶，酪氨酸酚解酶催化鄰苯二酚、丙酮酸和氨生成左旋多巴中，添加 Na2S2O3以及 EDTA，可以提高產(chǎn)率。本實(shí)驗(yàn)中添加Na2S2O3對(duì)LmbB2合成左旋多巴沒有效果。Seetharam等［9］在生物合成左旋多巴中使用了NADH或者羥胺。

無論是在固定化酪氨酸酶中［10-11］，還是在用菌體催化L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴，使用抗壞血酸效果最好。Mariam等［12］在米曲霉轉(zhuǎn)化左旋多巴的反應(yīng)體系中添加抗壞血酸，可以使酶從預(yù)先生長的菌絲體中游離出來，在體外直接參與催化活動(dòng)，減少底物吸收進(jìn)入細(xì)胞的過程。Ho等［13］研究表明，添加抗壞血酸可以使反應(yīng)體系中生成的多巴醌重新還原為左旋多巴。在本實(shí)驗(yàn)中，抗壞血酸的添加效果顯著，左旋多巴大量積累。但當(dāng)抗壞血酸消耗完全之后，這種效應(yīng)消失，如圖8所示，在發(fā)酵36 h后，左旋多巴積累減少，發(fā)酵液開始變?yōu)樽睾谏?/p>

在L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為左旋多巴的生物合成中，由于產(chǎn)物已被酶促和非酶促氧化，而不穩(wěn)定。添加抗壞血酸具有很好的穩(wěn)定作用，其效應(yīng)與轉(zhuǎn)化酶或微生物、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件等有密切關(guān)系。本論文以300 mg/L L-酪氨酸，表達(dá) LmbB2的工程大腸桿菌，添加3.0 g/L L-抗壞血酸，37℃下發(fā)酵培養(yǎng)36 h，獲得左旋多巴的產(chǎn)量最高，是適宜的工藝條件。然而，添加抗壞血酸，增加了成本和工藝控制的復(fù)雜程度。在今后研究中，應(yīng)該從代謝工程角度，平衡細(xì)胞內(nèi)的氧化還原，開發(fā)左旋多巴的新轉(zhuǎn)化工藝。

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