龔達(dá)平

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煙草重要基因篇：1. 煙草抗病相關(guān)基因

龔達(dá)平

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是研究植物與病害互作的主要模式生物。煙草病害種類(lèi)泛多，對(duì)煙草危害較為嚴(yán)重的病害有黑脛病、赤星病、青枯病、煙草普通花葉病、黃瓜花葉病、馬鈴薯Y病毒等?；瘜W(xué)藥劑防治會(huì)引起環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、煙葉安全性等問(wèn)題，而培育煙草抗病新品種是解決這些問(wèn)題的根本途徑。煙草抗病相關(guān)基因或分子標(biāo)記的獲得可高效靶向加快培育煙草抗病新品種的步伐。

1 抗黑脛病相關(guān)基因

煙草黑脛病由真菌（）引起。張錦偉等[1]以高抗黑脛病的煙草品種K326苗期接種黑脛病菌絲3天后取葉片構(gòu)建了cDNA文庫(kù)。蘇振剛等[2]以煙草黑脛病抗性品種革新3號(hào)為材料，利用黑脛病0號(hào)生理小種誘導(dǎo)構(gòu)建抑制差減（SSH）文庫(kù)，篩選出57個(gè)對(duì)煙草黑脛病抗性相關(guān)的差異表達(dá)基因。肖炳光[3]利用感黑脛病品種紅花大金元和抗黑脛病種質(zhì)RBST構(gòu)建BC1（紅花大金元/RBST//紅花大金元）群體，將抗黑脛病基因Ph精確定位在標(biāo)記TM10401和PT52634間的0.191 cM范圍內(nèi)。肖炳光等[4]（2013）利用抗黑脛病雪茄品種Florida 301和感黑脛病品種Hicks的重組自交系群體，鑒定了11個(gè)QTL，其中貢獻(xiàn)最大的一個(gè)QTL解釋了16.9%的大田表型變異和18.6%的溫室表型變異。Vontimitta等[5]（2012）利用Beinhart 1000和Hicks構(gòu)建的DH群體，鑒定了6個(gè)QTL，其中位于4號(hào)和8號(hào)染色體的兩個(gè)位點(diǎn)分別解釋了25.4%和20.4%的表型變異。

2 抗赤星病相關(guān)基因

煙草赤星病由赤星病菌（）引起。童治軍等[6]（2012）以感赤星病品種長(zhǎng)脖黃和抗赤星病品種凈葉黃構(gòu)建F2群體，利用SSR標(biāo)記在3個(gè)連鎖群上檢測(cè)到3個(gè)與赤星病抗性相關(guān)的QTL，抗性等位基因均來(lái)自凈葉黃。這3個(gè)QTL解釋了雙親病情指數(shù)差值的86%左右，其中約61%為加性效應(yīng)。蔣彩虹等[7]（2013）以抗煙草赤星病品種凈葉黃與感病品種NC82構(gòu)建F2代分離群體，獲得了一個(gè)抗赤星病基因的SSR標(biāo)記連鎖群M，該連鎖群包括12個(gè)標(biāo)記，全長(zhǎng)181.5 cM，平均間距15.1 cM，抗性基因被定位在標(biāo)記J4與J9之間，其中與J9的遺傳距離僅為4 cM。

3 抗青枯病相關(guān)基因

煙草青枯病是一種由青枯菌（）引起的細(xì)菌性病害。楊柳[8]（2012）以中抗青枯病品種巖煙97和感病品種紅花大金元雜交得到的237個(gè)F2:3家系為作圖群體，利用SSR標(biāo)記檢測(cè)到2個(gè)主效QTL，分別位于第17a、17b連鎖群上，分別解釋了25.7%和13.28%的表型變異。在聯(lián)合分析時(shí)，檢出2對(duì)具有上位效應(yīng)的QTL，貢獻(xiàn)率分別為4.73%和3.91%。Qian Y L等[9]（2013）利用Enshu×TI448A和Yanyan97×TI448A的F2群體，鑒定了位于連鎖群3和5上的4個(gè)QTL位點(diǎn)（qBWR-3a，qBWR-3b，qBWR-5a和qBWR-5b）；這4個(gè)位點(diǎn)分別解釋了9.00、19.70、17.30和17.40%的表型變異。

4 抗煙草普通花葉病毒相關(guān)基因

煙草普通花葉病毒病在我國(guó)各產(chǎn)煙區(qū)均有分布，病原為煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）。煙草N基因是理想的抗TMV基因，它和TMV之間的互作是植物和病毒互作領(lǐng)域的經(jīng)典系統(tǒng)。N基因起源于粘毛煙草（），是Whitham等[10]（1994）和Dinesh-Kumar等[11]（1995）利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法進(jìn)行分離的，其結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)特點(diǎn)都得到了深入研究。N基因編碼一個(gè)131.4 kDa的蛋白質(zhì)，屬于典型的TIR-NBS-LRR抗病基因。Padgett等[12]（1993）報(bào)道，TMV復(fù)制酶126/183 Kda蛋白是激發(fā)N基因介導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)（HR）所必須的；后來(lái)Erickson等[13]（1999）用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的表達(dá)策略證明，50 kDa TMV解旋酶片段（p50）足以引發(fā)N基因介導(dǎo)的HR。Dinesh-Kumar等[14]（2000）證實(shí)，N基因的5個(gè)外顯子經(jīng)選擇性剪切可編碼NS和NL兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物；在TMV侵染后3 h之內(nèi)以NS為主；4~8 h以NL為主。煙草N基因介導(dǎo)的TMV抗性是識(shí)別病原經(jīng)系列信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)。N基因介導(dǎo)的HR是第一個(gè)防衛(wèi)反應(yīng)，可限制TMV于枯斑及其鄰近部位；HR隨后誘導(dǎo)整個(gè)植株非特異的普遍的防衛(wèi)反應(yīng)即系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）。

5 抗黃瓜花葉病毒相關(guān)基因

煙草黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus, CMV）是世界上分布最廣的植物病毒之一，其株系繁多，每年都給煙葉生產(chǎn)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。文軻等[15]（2013）以感CMV品種NC82和抗CMV品種臺(tái)煙8號(hào)及其F1為材料，從2317對(duì)SSR引物中篩選出127對(duì)多態(tài)性引物。進(jìn)一步挑選62對(duì)SSR引物，對(duì)經(jīng)過(guò)CMV接種鑒定的288個(gè)BC1（NC82/臺(tái)煙8號(hào)//NC82）單株進(jìn)行標(biāo)記定位分析。采用復(fù)合區(qū)間作圖法進(jìn)行QTL定位，檢測(cè)到一個(gè)QTL位于10號(hào)連鎖群上，在標(biāo)記53735與54196之間，標(biāo)記53735與抗性緊密連鎖，遺傳距離為0.1 cM，貢獻(xiàn)率為13%，暫命名為qCMV-1，其抗性等位基因來(lái)自臺(tái)煙8號(hào)。

6 抗馬鈴薯Y病毒相關(guān)基因

煙草馬鈴薯Y病毒?。╬otato virus Y，PVY）是煙區(qū)的主要病毒病害。陳帥等[16-17]（2010）和周佳等[18]（2010）以不同PVY誘導(dǎo)時(shí)期的白肋煙品種VAM葉片mRNA作為探針，利用cDNA芯片篩選已構(gòu)建的抑制差減雜交文庫(kù)，共有915個(gè)克隆為表達(dá)上調(diào)（Ratio＞2）；對(duì)上調(diào)表達(dá)明顯的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp、NtERD1和NtPsaN進(jìn)行了全長(zhǎng)克隆和表達(dá)分析，它們受到PVY的顯著誘導(dǎo)。Julio等[19]（2013）利用Illumina測(cè)序技術(shù)，對(duì)12個(gè)F7重組自交系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了在感病材料中高表達(dá)，而在抗病材料中不表達(dá)的真核細(xì)胞翻譯起始因子4E（eIF4E）。進(jìn)一步對(duì)100個(gè)F8重組自交系的PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了感病性與eIF4E表達(dá)的相關(guān)性；利用F2分離群體進(jìn)行標(biāo)記定位也證實(shí)了eIF4E基因突變與PVY抗性完全連鎖；通過(guò)篩選EMS誘導(dǎo)的突變?nèi)后w，獲得了兩個(gè)eIF4E基因提前終止的抗PVY突變體。

7 問(wèn)題與展望

抗TMV的N基因和抗PVY的eIF4E基因均是單基因，很容易進(jìn)入煙草的育種程序，但其他主要病害還需要進(jìn)一步進(jìn)行QTL的精細(xì)定位。隨著煙草基因組測(cè)序的完成和功能基因組的開(kāi)展，將加快對(duì)煙草抗病基因的深入研究，如據(jù)王元英[20]（2011）分析，煙草基因組中包含400多個(gè)NBS-LRR類(lèi)抗病基因。分子育種必將成為今后煙草抗病育種的主要手段。

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