Serratia marcescens H30脂肪酶的重組可溶表達、固定化及其酶學性質(zhì)

徐晶晶，蘇二正，吳向萍，馬昱澍，魏東芝

(1.華東理工大學魯華生物技術(shù)研究所生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237；2.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院酶與發(fā)酵工程實驗室，南京210037)

Serratia marcescens H30脂肪酶的重組可溶表達、固定化及其酶學性質(zhì)

徐晶晶1，蘇二正2，吳向萍1，馬昱澍1，魏東芝1

(1.華東理工大學魯華生物技術(shù)研究所生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海200237；2.南京林業(yè)大學輕工科學與工程學院酶與發(fā)酵工程實驗室，南京210037)

為了提高SerratiamarcescensH30脂肪酶的可溶表達水平，分別將目的基因與pGEX-4T-1、pET28a和pET32a構(gòu)建重組表達載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，通過優(yōu)化誘導過程，發(fā)現(xiàn)可溶性酶的最高活性可達25 000 U/L。再經(jīng)Ni2+親和柱純化、LH-EP固定化后，固定化酶的比酶活為214 U/g(以1 g濕質(zhì)量計)，酶活回收率為51%。固定化后重組脂肪酶的最適溫度由30 ℃提高到35 ℃，最適pH從7.0偏移至8.0左右，并且穩(wěn)定性也有所增加。該固定化重組脂肪酶同樣能夠拆分消旋體反式-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，光學選擇性沒有改變。反應(yīng)14 h，轉(zhuǎn)化率為48.5%，底物的e.e.值為99.2%，表明該固定化脂肪酶能有效拆分消旋體反式-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，為工業(yè)生物催化制備地爾硫卓提供了可能。

黏質(zhì)沙雷氏菌；脂肪酶；可溶表達；固定化；手性拆分

脂肪酶(EC 3.1.1.3)又稱三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，它可將中長鏈甘油三酯催化水解成甘油和脂肪酸。除水解反應(yīng)以外，脂肪酶還能催化酯化、酯交換、氨解、醇解等多種反應(yīng)，并且在非水相體系中具有高度的區(qū)域選擇性和立體選擇性。因此，脂肪酶在食品工業(yè)、醫(yī)藥化妝品、生物柴油、手性化學品拆分制備方面發(fā)揮著重要作用[1-2]。

與其他細菌脂肪酶相比，來源于黏質(zhì)沙雷氏菌的脂肪酶因能高立體選擇性催化拆分消旋體反式-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲酯((±)-MPGM)，得到冠狀血管舒張劑藥物順式地爾硫卓制備的關(guān)鍵中間體 (2R,3S)-4-甲氧苯基縮水甘油酸甲酯，即(-)-MPGM而備受關(guān)注[3-4]。Idei等[5]克隆得到黏質(zhì)沙雷氏菌Sr41 8000的脂肪酶基因，并將其與信號肽共同構(gòu)建到載體pUC19上再轉(zhuǎn)化到野生型菌株中進行表達，使酶產(chǎn)量增加了近140倍，之后又使用膜反應(yīng)器對該脂肪酶固定化，并用于拆分消旋體(±)-MPGM。目前，人們已經(jīng)從黏質(zhì)沙雷氏菌中克隆該脂肪酶基因，并在大腸桿菌中進行了表達，但大多數(shù)表達產(chǎn)物都以無活性的包涵體形式存在[6-8]。因此，如何實現(xiàn)該脂肪酶的高水平活性表達是一個亟待解決的難題。一般可以通過2種途徑來實現(xiàn)：一是對重組脂肪酶包涵體進行變復性以重新獲得有活性的酶，但這種方法由于操作繁瑣、耗時較長不能用于工業(yè)化生產(chǎn)；二是構(gòu)建能可溶表達該脂肪酶的表達系統(tǒng)或通過優(yōu)化目的蛋白的表達條件，實現(xiàn)可溶活性表達。

SerratiamarcescensH30為華東理工大學魯華生物技術(shù)研究所篩選獲得的1株高產(chǎn)2,3-丁二醇菌株，筆者以SerratiamarcescensH30基因組為模板克隆獲得其脂肪酶基因，構(gòu)建多個原核表達系統(tǒng)，以可溶性表達為目的優(yōu)化其表達條件， 隨后對該脂肪酶進行純化、固定化，并研究其理化性質(zhì)，為地爾硫卓規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株和材料

菌株E.coliDH5α、E.coliBL21 (DE3)、SerratiamarcescensH30、表達載體pGEX-4T-1、pET28a、pET32a均為華東理工大學魯華生物技術(shù)研究所保藏；質(zhì)粒PMD19-T購自TaKaRa公司； Taq DNA聚合酶、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker購于上海捷瑞生物工程有限公司；聚乙烯醇、橄欖油均購于中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司；異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、氨芐青霉素購于Sigma公司；其他生化試劑均為市售國產(chǎn)分析純。

1.2 脂肪酶基因的克隆和表達

根據(jù)GenBank上提交的黏質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因設(shè)計并合成特異性引物，正向引物5′-G￣G￣T￣T￣G￣A￣A￣T￣T￣C￣G￣G￣C￣A￣T￣C￣T￣T￣T￣A￣G￣C￣T￣A￣T￣A￣A￣G￣G￣A-3′(下劃線為EcoRⅠ酶切位點)，反向引物為5′-C￣C￣T￣T￣G￣C￣G￣G￣C￣C￣G￣C￣T￣A￣G￣G￣C￣C￣A￣A￣C￣A￣C￣C￣A￣C￣C￣T￣G￣A￣T￣C-3′ (下劃線為NotⅠ酶切位點)，以黏質(zhì)沙雷氏菌H30基因組為模板進行PCR擴增。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體并測序。把經(jīng)測序驗證的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后電泳回收DNA片段，用T4DNA連接酶連接到同樣經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切的pET28a、 pET32a和pGEX-4T-1中，構(gòu)建表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)雙酶切、測序驗證正確后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)進行初步表達。在LB培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0)中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD 為0.6～0.8左右，加入0.1% (體積分數(shù)) 1 mol/L的誘導劑IPTG于30 ℃培養(yǎng)8 h后離心收集菌體。將菌體重懸于25 mL 25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中，超聲波破碎菌體后高速離心，對上清與沉淀分別取樣，進行SDS-PAGE電泳分析。

1.3 脂肪酶的酶活測定

脂肪酶的活力測定以橄欖油為底物采用NaOH滴定法[9]。0.5 mL適當稀釋的酶液或10～50 mg固定化酶、100 mmol/L pH 7.0的磷酸鈉緩沖液2.0 mL的測酶活體系于搖床上30 ℃保溫5 min左右，加入預保溫的乳化橄欖油底物2.5 mL開始反應(yīng)，10 min后用10 mL終止液(無水乙醇與丙酮按照體積比1∶ 1混合)終止反應(yīng)，對于游離酶空白對照中先加終止液再加底物，對于固定化酶空白對照中加終止液后煮沸10 min再加底物。脂肪酶催化橄欖油水解產(chǎn)生的游離脂肪酸的量通過50 mmol/L的NaOH滴定測得，加2滴0.05%(質(zhì)量分數(shù))酚酞指示滴定終點。在上述條件下，脂肪酶水解底物每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸所需的酶定義為一個活力單位(U)。

1.4 重組脂肪酶的分離純化

用鎳柱對重組脂肪酶進行分離純化。離心收集50 mL 發(fā)酵液的菌體，重懸于25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)緩沖液中，超聲波破碎菌體，高速離心分離上清和沉淀；將上清5 mL以1.0 mL/min 的速度加樣到柱體積為1 mL的Ni-NTA Sepharose 親和柱上，基本流動相為含200 mmol/L NaCl的25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 緩沖液；用20 mmol/L咪唑進行沖洗，穿出峰過后，用濃度梯度為50、80、100和200 mmol/L的咪唑流動相洗脫，分別收集洗脫組分進行SDS-PAGE電泳分析。

1.5 脂肪酶的固定化

稱取0.5 g環(huán)氧載體LH-EP加入5 mL純化的脂肪酶溶液中。在25 ℃和200 r/min下開始固定化。16 h后，用砂芯漏斗濾出固定化酶，用去離子水充分清洗并過濾抽干。測定固定化溶液中的蛋白濃度及固定化脂肪酶的活力，計算固定化率及酶活力回收率。

稱取2.5 g 氨基載體LH-HA，加入10 mL pH 8.0的0.02 mol/L的磷酸鉀緩沖液(含有2.0% (體積分數(shù))的戊二醛)中，在25 ℃ 和200 r/min下活化2 h，活化結(jié)束后用去離子水充分清洗直至聞不出戊二醛味。稱取0.5 g 活化的氨基載體LH-HA，按照環(huán)氧基載體同樣的方法進行固定化。10 h后，用砂芯漏斗濾出固定化酶，并依次用去離子水、1 mol/L的NaCl溶液、0.02 mol/L pH 8.0的磷酸鉀緩沖液充分清洗，過濾抽干。測定固定化溶液中的蛋白濃度及固定化脂肪酶的活力，計算固定化率及酶活力回收率。

1.6 脂肪酶的性質(zhì)研究

1)最適溫度 取適量的純化脂肪酶液或固定化脂肪酶，分別于25～60 ℃下測定酶活。將最適溫度下的酶活定義為100%，計算相對酶活。

2)最適pH 取適量的純化脂肪酶液或固定化脂肪酶，在30 ℃下分別于pH 3.0～10.0的磷酸-硼酸-檸檬酸緩沖液中測定酶活。將最適pH下的酶活定義為100%，計算相對酶活。

3)熱穩(wěn)定性 取適量的純化脂肪酶液或固定化脂肪酶，加入5 mL pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，置于不同溫度(25～60 ℃)下,保溫6 h后，測定殘余酶活。

4)pH穩(wěn)定性 取適量的純化脂肪酶液或固定化脂肪酶，置于25 mL的具塞三角燒瓶中，依次加入5 mL、pH 3.0～10.0的磷酸-硼酸-檸檬酸緩沖液， 于25 ℃放置12 h后，測定殘余酶活。

1.7 固定化脂肪酶拆分地爾硫卓中間體

在25 mL具塞三角瓶中加入5 mL甲苯，5 mL Tris-HCl緩沖液(200 mmol/L，pH 8.0)，100 mmol/L (±)-MPGM，0.1 g 固定化脂肪酶，置于30 ℃的恒溫搖床150 r/min進行反應(yīng)，一定時間后取樣,10 000 r/min離心10 min，分離有機相和水相，取有機相進行HPLC檢測。手性柱為日本大賽璐公司的Chiralcel OJ，流動相為正己烷-異丙醇混合液(兩者體積比為60∶ 40)，柱溫控制在20 ℃，流速為0.8 mL/min，檢測波長254 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 H30脂肪酶的克隆與表達

以S.marcescensH30的基因組DNA為模板，通過PCR(94 ℃ 0.5 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán))獲得2 000 bp左右的擴增產(chǎn)物，與預期的目的基因大小相符。將PCR獲得的脂肪酶基因片段經(jīng)膠回收純化后，與pMD19-T載體連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5α，篩選重組子經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的重組菌送樣測序，測序結(jié)果經(jīng)BLAST進行同源性比對分析，與GenBank中已提交的黏質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶基因同源性為98%。

將成功構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-lipase、pET32a-lipase和pGEX-4T-1-lipase分別轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)中并進行誘導表達。在30 ℃條件下，IPTG誘導8 h后，收集菌體超聲破碎后離心，所得的上清液與沉淀分別進行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知：重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase中脂肪酶主要以非可溶性包涵體形式表達為主(圖1(a)泳道5)，重組菌E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-lipase的表達產(chǎn)物中，脂肪酶的可溶表達與包涵體約各占一半(圖1(c)泳道4和5)，而重組菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase中脂肪酶主要以可溶性表達為主(圖1(b)泳道4)。就脂肪酶在重組菌中的表達量而言，重組菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase和E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase中脂肪酶的表達總量較高，而E.coliBL21(DE3)/pGEX-4T-1-lipase中的脂肪酶表達量較低。

1—空載體空白對照; 2—誘導前空白對照; 3—誘導后全菌體; 4—誘導后上清; 5—誘導后沉淀; M—標準蛋白圖1 大腸桿菌重組S.marcescens H30脂肪酶的誘導表達Fig.1 Recombinant expression of S.marcescens H30 lipase in E.coli

測定重組菌表達脂肪酶的比酶活表明：重組菌E.coliBL21(DE3)/pET32a-lipase表達脂肪酶的比酶活最高，達到5 000 U/L；重組菌E.coliBL21(DE3)/ pGEX-4T-1-lipase表達脂肪酶比酶活次之，達到2 000 U/L；重組菌E.coliBL21(DE3)/pET28a-lipase表達脂肪酶比酶活最低，僅為500 U/L左右。原始S.marcescensH30表達的脂肪酶比酶活為400 U/L左右，可以看出在大腸桿菌中重組表達后，脂肪酶的表達酶活都有了不同程度的提高。

結(jié)合重組菌中脂肪酶的表達狀況及其表達酶活，后續(xù)表達條件優(yōu)化以重組菌E.coliBL21(DE3)/ pET32a-lipase作為研究對象。

2.2 表達條件優(yōu)化

為了獲得更理想的表達結(jié)果，在LB培養(yǎng)基中對重組菌E.coliBL21(DE3)/ pET32a-lipase的誘導表達條件如誘導溫度、誘導劑IPTG濃度、誘導時間等進行了優(yōu)化。得到重組脂肪酶誘導表達的最佳條件：25 ℃，IPTG濃度0.8 mmol/L，誘導時間為12 h。同時，發(fā)現(xiàn)添加誘導劑IPTG的同時，添加終濃度為5 mmol/L的CaCl2，能使脂肪酶的表達活力提高1.6倍(圖2)。在最優(yōu)條件下誘導表達，重組菌OD600最高達到16.2，脂肪酶比酶活達到25 000 U/L(圖3)，比文獻[6-8]報道的結(jié)果要高。

圖2 Ca2+濃度對E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase 重組脂肪酶誘導表達的影響Fig.2 Effects of Ca2+ concentration on lipase expression of E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase

圖3 E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase重組脂肪 酶誘導表達進程曲線Fig.3 Time courses of recombinant lipase expression in E.coli BL21(DE3)/pET32a-lipase

2.3 重組脂肪酶的純化

利用pET32a 融合表達在目的蛋白的C末端的His-tag，通過Ni2+親和柱進行分離純化。SDS-PAGE電泳結(jié)果見圖4。由圖4可知：采用80 mmol/L以上濃度的咪唑能獲得純度較高的目的蛋白。但同時考慮到過高的鹽濃度會降低脂肪酶的活性，所以選用80 mmol/L咪唑作為純化該脂肪酶時的洗脫濃度。

1、2—50 mmol/L 咪唑洗脫峰；3、4—80 mmol/L咪唑洗脫峰；5、6—100 mmol/L咪唑洗脫峰 7—200 mmol/L咪唑洗脫峰圖4 咪唑洗脫濃度對純化脂肪酶影響Fig.4 Effects of imidazole concentration on purification of lipase

2.4 重組脂肪酶的固定化

為了尋找對重組脂肪酶固定化效果較好的載體，考察氨基載體和環(huán)氧載體對脂肪酶的固定化效果，結(jié)果見表1。由表1可知：環(huán)氧載體LH-EP的固定化率為76%，酶活回收率為51%，最終固定化酶比酶活達到214 U/g(以1 g菌體濕質(zhì)量計)；氨基載體LH-HA對蛋白的固定化率以及酶活回收率均不高，分別為63%和23%，最終的固定化酶比酶活也僅達到103 U/g。由此可以看出LH-EP是一個較適宜的固定化載體。

表1 不同固定化載體對脂肪酶的固定化效果

2.5 重組脂肪酶的酶學性質(zhì)

考察純化的游離脂肪酶及環(huán)氧載體LH-EP固定化脂肪酶的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果見圖5。由圖5可知：固定化后脂肪酶的最適水解溫度與游離酶相比從30 ℃提高到35 ℃。當溫度升至45 ℃時，游離酶活性顯著下降，與之相比固定化酶則保留約60%的活性。當溫度升高至50 ℃以上后游離酶和固定化酶都迅速失活。

圖5 重組脂肪酶的最適溫度Fig.5 Optimal temperature of recombinant lipase

pH是影響酶催化活性的主要因素之一，因此考察pH對重組脂肪酶活力的影響，結(jié)果見圖6。由圖6可知：經(jīng)LH-EP固定化后的脂肪酶，其最適pH從7.0偏移至8.0左右。究其原因可能是由于酶分子所帶電荷在固定化后發(fā)生了改變。通常情況下，帶負電荷的載體往往導致固定化酶的最適pH向堿性偏移，而帶正電荷的載體則將使固定化酶的最適pH比游離酶低。

圖6 重組脂肪酶的最適pHFig.6 Optimal pH of recombinant lipase

脂肪酶經(jīng)LH-EP固定化后溫度和pH穩(wěn)定性也發(fā)生改變，結(jié)果見圖7和圖8。由圖7可知：當溫度在35 ℃以下時，游離酶和固定化酶的穩(wěn)定性沒有太大差別，當溫度升至40 ℃以上時，游離酶迅速失活，45 ℃時酶活只剩下35%左右，而固定化酶的熱穩(wěn)定性有所提高，在45 ℃放置6 h以后，殘余酶活還有60%以上。同時，游離酶和固定化酶都不能耐受60 ℃以上的高溫。

圖7 重組脂肪酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of recombinant lipase

圖8為固定化后對脂肪酶的pH穩(wěn)定性。由圖8可知：固定化后脂肪酶的穩(wěn)定性有一定程度的增加，在pH4.0的緩沖液中存放12 h后，固定化酶的殘余酶活為40%左右，而游離酶只剩25%左右；在pH大于8.0的緩沖液中存放12 h后，游離酶迅速失活，而在pH 10.0的緩沖液中固定化酶殘余酶活仍然保持在35%左右。

圖8 重組脂肪酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of recombinant lipase

2.6 固定化重組脂肪酶對地爾硫卓中間體的拆分

利用質(zhì)粒pET32a上的Trx標簽與S.marcescensH30脂肪酶進行融合表達，顯著提高了脂肪酶的可溶表達比例。由于Trx標簽過大，與脂肪酶融合后可能影響其催化效果，特別是其催化拆分的光學選擇性。此外，固定化也會對酶的催化性能產(chǎn)生影響。為此，按照1.7的方法考察固定化重組S.marcescensH30脂肪酶對地爾硫卓中間體的拆分效果。結(jié)果顯示，固定化脂肪酶能夠特異性拆分(±)-MPGM，且優(yōu)先催化R構(gòu)型，催化拆分的光學選擇性與原始游離脂肪酶一致，說明融合表達、固定化均沒有改變該脂肪酶催化拆分的光學選擇性。經(jīng)過14 h的反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率為48.5%，底物的e.e.值為99.2%，表明本文制備的固定化重組脂肪酶對(±)-MPGM具有很好的拆分效果，具備工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

3 結(jié) 論

成功克隆了S.marcescensH30的脂肪酶基因，

通過對表達載體和誘導條件的優(yōu)化，實現(xiàn)了可溶表達，在搖瓶中重組脂肪酶比酶活達到25 000 U/L。并通過鎳柱進行純化，環(huán)氧載體固定化，固定化脂肪酶最適溫度為35 ℃，最適pH 8.0，在低于45 ℃，pH為5.0～8.0條件下比較穩(wěn)定。該固定化脂肪酶能有效拆分(±)-MPGM，為工業(yè)生物催化制備地爾硫卓提供了可能。

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(責任編輯 荀志金)

Recombinant soluble expression,immobilization and characterizationof lipase from Serratia marcescens H30

XU Jingjing1,SU Erzheng2,WU Xiangping1,MA Yushu1,WEI Dongzhi1

(1.State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,New World Institute of Biotechnology,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China; 2.Enzyme & Fermentation Engineering Laboratory,College of Light Industry Science and Engineering,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China)

To enhance the recombinant soluble expression of lipase fromSerratiamarcescensH30 inE.coli,different expression vectors such as pGEX-4T-1,pET28a and pET32a were studied.After optimization of inducing conditions,the maximum lipase activity reached to 25 000 U/L in shake flasks.The recombinant lipase was purified by Ni-NTA superflow column.Two carriers were used to immobilize the recombinant lipase,and LH-EP was the best one.Optimal temperature and pH of the immobilized lipase were 35 ℃ and 8.0,respectively.The thermal and pH stability of the lipase was improved after being immobilized onto LH-EP.The kinetic resolution of (±)-MPGM by immobilized lipase was studied,and a conversion of 48.5% was achieved along with ane.e. value of 98.2%.Our study reveals the good potential of immobilizedSerratiamarcescensH30 lipase for application in industrial production of diltiazem.

Serratiamarcescens;lipase;soluble expression;immobilization;characterization;resolution

10.3969/j.issn.1672-3678.2014.06.007

2013-08-27

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(2012CB721103、2012CB721003); 國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA022206B、2012AA020403)；國家自然科學基金(31201296/C200101)；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金；生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室開放課題

徐晶晶(1987—)，女，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向：酶工程；蘇二正(聯(lián)系人)，副教授，E-mail:ezhsu@njfu.edu.cn

TQ925

A

1672-3678(2014)06-0033-06