魯曉萍，王大濤，孫紅梅，褚文輝，趙海平，章秀婷，李春義

(中國農業(yè)科學院特產研究所吉林省特種經(jīng)濟動物分子生物學省部共建實驗室，長春130112)

鹿茸為雄性鹿頭蓋骨部分的附屬器官，不同于其他反芻動物中空的角組織，其為皮膚包裹的骨組織，富含有血管、神經(jīng)。鹿茸是唯一一個能夠每年周期性和完全再生的哺乳動物器官。鹿茸再生過程伴隨著皮膚、血管、神經(jīng)的再生，生長速度為1cm/d～2cm/d且無癌變發(fā)生。鹿茸再生的過程中，鹿角脫落面無傷疤形成，同時鹿茸作為鹿頭部表面附屬器官方便觀察和獲取，發(fā)育和再生在同一機體上產生有利于比較，發(fā)育和再生過程可以人工誘導等優(yōu)勢，因此將成為一個很好的再生醫(yī)學研究模型。為了更好地發(fā)展鹿茸這一再生醫(yī)學模型，必須對鹿茸發(fā)育機制進行更深的研究。鹿茸發(fā)育過程包括發(fā)生和再生2個階段，鹿茸再生重演鹿茸發(fā)生的過程。鹿茸發(fā)生過程包括角柄形成和鹿茸發(fā)育2個過程。鹿茸角柄和鹿茸都是由外部皮膚和內部骨組織2部分組成，其中富含有神經(jīng)和血管。鹿茸發(fā)育過程先有內部骨組織形成變化，然后外部鹿茸角柄遠端皮膚由鹿皮轉變?yōu)槿灼?。鹿茸的發(fā)育、再生是基于鹿茸生茸區(qū)骨膜(antlerogenic periosteum，AP)和角柄骨膜(pedicle periosteum，PP)同其上覆蓋的皮膚相互作用的過程。實驗證明這個相互作用過程是基于干細胞的分裂、分化過程，AP細胞為鹿茸干細胞[1]，是鹿出生后遺留的胚胎組織[2]。鹿茸發(fā)育的機制受多種因素的調控，如光照、生長因子、激素等調控。本文就目前鹿茸發(fā)育的組織來源、組織細胞特性及其組織間的相互作用的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 調控鹿茸發(fā)生和再生的組織來源

鹿茸發(fā)生時不是直接生長于額骨上，而是從角柄(永久性骨樁組織)上長出，角柄不是與生俱來的，角柄來源于額外脊上的生茸區(qū)骨膜(AP)。母鹿和公鹿額骨處都有AP，但是在大多鹿種中只有雄鹿生茸，而母鹿不能生茸，這是因為鹿茸的生成需要有雄激素的刺激[3]。組織學觀察和遺傳標記追蹤細胞分裂趨向證明角柄和鹿茸都來源于AP細胞的分裂和分化[4]。此外組織學實驗證明鹿茸發(fā)生和再生來源于角柄骨膜，經(jīng)過PP全部和部分切除實驗證實PP為鹿茸再生組織，PP由AP分化而來[5]。骨膜異位移植實驗證實了AP具備胚胎組織的特性，在體外培養(yǎng)時，具有巨大的再生潛力，AP細胞表面富含糖原[6]。通過實驗方法切除掉AP導致角柄不能發(fā)生，將AP進行同體異位移植將產生異位角柄和鹿茸，AP切除和移植實驗證實了誘導鹿茸發(fā)生的AP閾值面積是15mm2，AP細胞可以分化成鹿茸，同時AP包含有鹿茸形態(tài)生成的信息[7]，將AP分成前、后、中間、側邊4個部分進行異位移植進一步證實了AP包含有鹿茸形態(tài)的信息[8]。

異位移植AP需要與覆蓋其上的鹿額外脊皮膚相互作用，才能使鹿茸發(fā)生和皮膚轉變?yōu)槿灼?。但是鹿的鼻子、脊背部、尾巴腹?個部位的皮膚不可以和AP進行這種相互作用，因為這3個部位缺少毛囊細胞[9]。通過在皮膚和AP之間插入不透膜實驗證實了異位移植AP需要與相應的皮膚相互作用才能導致鹿茸的生成和鹿皮膚類型的轉變[10]。只有皮膚和骨膜接觸緊密時，骨膜才能和皮膚相互作用[11]，內部不斷生長的角柄由雄性激素刺激，不同鹿種這2種組織達到緊密接觸的時間不同，因此生長出鹿茸時，角柄的高度也不一樣[12]。PP組織發(fā)育成鹿茸時，只有角柄主干遠端與皮膚緊密接觸，該區(qū)域大約為角柄高度的1/3(稱為致敏區(qū))部分能夠誘導鹿茸產生，而近端與皮膚松散接觸，該區(qū)域大約為角柄高度的2/3(稱為休眠區(qū))部分不能誘導鹿茸產生[13]，并且這2個區(qū)域的劃分是個動態(tài)過程，伴隨著年齡增長，角柄變短，依舊是角柄主干遠端大約1/3處同皮膚接觸緊密，角柄主干近端大約2/3處同皮膚接觸松散。插膜實驗同樣證實了鹿茸再生過程也需要PP和覆蓋的皮膚相互作用，鹿茸發(fā)生和再生均需要AP、PP和其上的皮膚發(fā)生緊密接觸后才能誘導鹿茸的發(fā)生和再生[13]。

研究證實鹿茸再生過程和鹿茸發(fā)生過程相似，鹿茸再生基因表達研究表明鹿茸再生分子機制重演鹿茸發(fā)生的過程[14，15]。細胞水平上的研究表明鹿茸發(fā)育和再生過程都依賴于AP和PP中的細胞群[16]，鹿茸發(fā)育和再生過程都是由皮膚和骨膜的相互作用激發(fā)的[17]，首先骨膜導致鹿皮膚轉化為茸皮，然后茸皮反饋激發(fā)骨膜細胞分裂增值，形成鹿茸組織。因此，鹿茸發(fā)生和再生的組織來源于AP、PP及其與它們緊密接觸的皮膚。

2 AP、PP細胞特性及其與覆蓋皮膚組織相互作用的機制

AP骨膜為直徑大約2.5cm、厚度約為2.5～3.0mm的組織片，大約500萬個細胞維持著鹿茸季節(jié)性再生。在短短的60d時間內，AP大約提供300萬個細胞，生長出大約10kg鹿茸組織。AP細胞和PP細胞都具有巨大的增生潛力。研究證實AP和PP組織細胞表面表達標記干細胞群的CD9抗原，標記多潛能細胞的Oct4、Nanog等抗原，此2種組織具有很高的端粒酶活性(與細胞自我更新有關)和表達核干細胞因子(控制干細胞分裂和蠑螈肢體再生)。PP細胞表達stro-1，為間充質祖細胞的標志。AP和PP表達標記的性質和范圍都表明AP和PP細胞具有胚胎干細胞性質。AP和PP細胞在分別有地塞米松和抗壞血酸鹽的微粒體培養(yǎng)時均能被誘導成軟骨細胞、成骨細胞，AP和PP在形成角柄和鹿茸時分裂出軟骨細胞和成骨細胞是必須的。當AP和PP細胞在有亞油酸或者兔血清的介質中培養(yǎng)時它們均能分化成脂肪細胞。這些都證明了這些細胞群為成體干細胞，具有多潛能分化特性[18，1]。

AP移植實驗證實：在鹿茸的皮膚轉變?yōu)槿灼で俺鬉P將中斷鹿茸皮膚類型轉變和鹿茸形成，皮下移植AP誘導鹿的皮膚向天鵝絨茸皮膚轉變和鹿茸生成[9]。異位移植AP和其上的皮膚，并且除掉皮下結締組織(SLCT)，證實了SLCT和部分皮膚在茸皮轉變過程中不是必須的，在移植的AP和上層皮膚之間插入半透膜2年后正常鹿皮轉變?yōu)榈湫偷娜灼?，然而插入不透膜的鹿茸皮膚依舊沒有轉變。這個實驗說明皮膚轉變需要AP的參與[10]，是AP分化過程中的分子誘導作用促使了鹿茸皮膚類型的轉變[19]。這些分子通過長距離旁分泌途徑作用于皮膚組織的毛囊根部，這些被誘導的皮膚毛囊細胞通過旁分泌或者近分泌途徑釋放小分子物質同其上的其他部分皮膚組織相互作用，誘導皮膚轉變?yōu)槿灼?。反過來，類型轉變的皮膚組織釋放小分子物質反饋作用于AP細胞層，誘導鹿茸發(fā)生。在鹿茸的再生過程中，通過PP剝離實驗[5]、PP和皮膚之間的插膜實驗[10]證實了PP是鹿茸再生不可缺少的組織，PP和其上的皮膚組織也是通過小分子物質的擴散進行相互作用的。由此看來誘導AP、PP同覆蓋其上皮膚組織相互作用的小分子物質在鹿茸發(fā)生和再生過程中具有重要意義，因此分離這些小分子物質并研究其作用機制將能更好地理解鹿茸發(fā)育機制，更好地應用于傷口愈合和人類組織再生，將對再生醫(yī)學有重大的影響。

3 鹿茸發(fā)育研究現(xiàn)狀及待解決的問題

研究證實鹿茸再生過程是由于PP同其上覆蓋的皮膚相互作用誘導的，誘導這種作用的物質不能透過一定厚度的纖維濾膜，主要是一些小肽物質(暫稱為小分子物質)，這種小分子物質是通過細胞旁分泌途徑進行的，因此分離這些小分子物質將成為研究鹿茸發(fā)育機制的重點。因為這些小分子物質是通過旁分泌的途徑進行的，因此可以在培養(yǎng)液中將這些小分子物質通過生物技術的方法進行分離。細胞共培養(yǎng)技術是將不同的細胞共培養(yǎng)于同一個環(huán)境中，這種技術可以模擬體內生成的微環(huán)境，便于更好地觀察細胞與細胞、細胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。目前我室的科研人員已建立了鹿PP細胞同PP毛囊細胞進行共培養(yǎng)的平臺，為分離這些有效小分子物質做了良好的鋪墊，同樣的細胞共培養(yǎng)方法可以將刺激鹿茸血管、神經(jīng)再生的物質進行分離。

PP來源于AP，鹿茸再生過程和鹿茸發(fā)生過程相似，但是PP組織不同于AP組織，AP導致了角柄的產生，PP導致了鹿茸的發(fā)生，皮下移植PP不能導致異位茸發(fā)生[16]，然而皮下移植AP能導致異位角柄和茸發(fā)生，但是該研究沒有進一步將角柄主干致敏區(qū)和休眠區(qū)的骨膜分別進行異位移植，以及將AP異位移植到角柄骨組織上面，只是初步證實AP一旦分化成PP就不具備鹿茸發(fā)育的能力，PP只能局限于再生。因此AP組織和PP組織在誘導鹿茸再生能力方面有巨大的不同。這種不同是由于PP位于角柄而AP位于額外脊處這種物理位置造成的生物力學效應導致PP再生能力改變還是由于AP轉變?yōu)镻P時細胞信號通路發(fā)生改變導致的，或者是因為PP包括致敏區(qū)和休眠區(qū)2個異質的部分，而整個AP區(qū)域與皮膚的相連的緊密程度沒有明顯的不同導致的這些都需要進一步地研究，此外角柄主干致敏區(qū)和休眠區(qū)的骨膜分別進行異位移植將會有什么不同也需要進一步地驗證，這些機制的研究將為如何將PP誘導成AP，然后進行異位移植產生更多的鹿茸打下基礎。

導致鹿茸發(fā)育和再生的AP和PP細胞具有干細胞特性，干細胞在調控鹿茸發(fā)育和再生的過程中具有復雜的機制，目前我們已經(jīng)明確地了解了鹿茸發(fā)育和再生的組織來源及其相互作用機制，需要進一步將生物力學、生物電學、分子生物學及細胞生物學等學科進行結合，從而更有力地去挖掘鹿茸發(fā)育和再生機制中的未知領域。

[1]Li C,Yang F,SheppardA.Adult stem cells and mammalian epimorphic regeneration-insights from studying annual renewal of deer antlers[J].Curr Stem Cells Res Ther,2009,(4):237-251.

[2]Li C,Suttie JM.Deer antlerogenicperiosteum:A piece of postnatally retained embryonic tissue?[J].AnatEmbryol,2001,(204):375-388.

[3]Suttie JM,Fennessy PF,Lapwood KR,et al.Role of steroids in antler growth of red deer stags[J].Exp Aool,1995,271:120-130.

[4]Li C,Suttie JM.Light microscopic studies of pedicle and early first antler development in red deer(Cervuselaphus )[J].Anat Rec,1994,239:198-215.

[5]Li C,Mackintosh CG,Martin SK,et al.Identification of key tissue type for antler regeneration through pedicle periosteum deletion[J].Cell Tissue Res,2007,328:65-75.

[6]Li C,Bing G,Zhang X,et al.Measurement of testosterone specific-binding(receptor)content of antlerogenic site periosteum in male and female sika deer[J].ActaVet Zoo-technicasinic,1990,21:11-14.

[7]Goss RJ,Powel RS.Induction of deer antlers by transplanted periosteum.Ⅰ.Graft size and shape[J].Exp Zool,1985,235:359-373.

[8]Gao Z,Yang F,Chris M,et al.Mapping the morphogenetic potential of antler fields through deleting and transplanting subregions of antleogenicperiosteum in sika deer(cervus Nippon)[J]．Anat,2012,220:131-143.

[9]Goss RJ.Induction of deer antlers by transplanted periosteum.Ⅱ.regional competence for velvet transformation in ectopic skin[J].Exp Zool,1987,244:101-111.

[10]Li C,Yang F,Xing X,et al.Role of heterotypic tissue interactions in deer pedicle and first antler formation-revealed via a membrane insertion approaxh[J].Exp Zool B Mol Dev Evol,2008,310:267-277.

[11]Li C,Suttie J.Histological studies of pedicle skin formation and its transformation to antler velvet in red deer(cervuselaphus)[J].Anat Rec,2000,260:62-71.

[12]Li C.Development of deer antler model for biomedical research[J].Recent advances and research updates,2003,(4):256-274.

[13]Li C,Yang F,Li G,et al.Antler regeneration:A dependent process of stem tissue primed via interaction with its enveloping skin[J].Exp Zool Part A Ecol Genet Physiol,2007,307:95-105.

[14]Faucheux C,Nicholls BM,Allen S,et al.Recapitulation of the parathyroid hormone-related peptide-indian hedgehog pathway in the regenerating deer antler[J].DevDyn,2004,231:88-97.

[15]Mount JG,Muzylak M,Allen S,et al.Evidence that the canonical Wnt signaling pathway regulates deer antler regeneration[J].DevDyn,2006,235:1390-1399.

[16]Li C,Mackintosh CG,Martin SK,et al.Identification of key tissue type for antler regeneration through pedicle periosteum deletion[J].Cell Tissue Res,2007,328:65-75.

[17]Li C,Yang F,Li G,et al.Antler regeneration: A dependent process of stem tissue primed via interaction with its enveloping skin[J].Exp Zool A Ecol Genet Physiol,2007,307:95-105.

[18]Rolf HJ,Kierdorf U,Kierdorf H,et al.Localization and characterization of STRO-1 cells in the deer pedicle and regenerating antler[J].PloS one,2008,34:2064.

[19]Li C.Exploration of the mechanism underlying neogenesis and regeneration of postnatal mammalian skindeer antler velvet[J].LJMBF,2012,(16):129-138.