郭利，王煒，張淑琴，孫娜，王鳳雪，武華

(中國農業(yè)科學院特產研究所省部共建特種動物分子生物學重點實驗室，長春130112)

隨著我國進出口貿易和養(yǎng)牛業(yè)的快速發(fā)展，牛系統(tǒng)性疾病時有發(fā)生且危害嚴重。研究表明，牛呼吸道疾病綜合征(Bovine respiratorydisease complex，BRDC)是由于牛生產運輸和早期斷奶造成的主要系統(tǒng)性疾病之一，由多個致病因子或病原包括應激、病毒和細菌的共同作用引起[1，2]，其中病毒的潛在感染是造成該病的重要原因之一，也是導致牛呼吸道疾病的啟動器。在牛呼吸道疾病中分離出的病毒主要包括牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)、牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和牛副流感3型病毒(BPIV3)。這些病毒常常形成持續(xù)性感染，嚴重影響架子牛生長及奶牛的產奶量和牛奶的質量。BRDC相關病毒中曾在水貂、雪貂分離到IBRV。雪貂、家兔、新生臭鼬可被人工感染，雪貂與兔可產生與牛相似的癥狀。BVDV還可感染鹿等特種經濟動物。本研究著重對BRDC相關病毒進行了多重PCR方法的建立及采集的臨床樣本檢測研究。目前，對BRDC相關病毒的檢測采用國家標準規(guī)定的血清中和試驗方法以及多聯PCR方法[3]。由于BRDC存在潛伏感染和長期排毒，血清中和試驗方法操作復雜且費時費力，進口試劑價格昂貴，檢測成本較高，并且局限在實驗室操作，很難實現推廣和應用；多聯PCR方法對BRDC相關病毒的檢測靈敏、經濟簡便，更適合推廣應用。目前多聯PCR方法在檢測時主要是針對BRSV、BVDV和BPIV3建立的PCR檢測方法[4～6]，由于IBRV基因組的GC含量高達72%，對PCR反應的試劑及條件要求苛刻，同時，GC的高含量給同一體系同時檢測牛呼吸道疾病綜合征的4種病原帶來極大困難，而臨床往往會發(fā)生同時感染的情況。本研究旨在建立一種能同時檢測牛呼吸道疾病綜合征的4種病原的多重PCR檢測技術。

1 材料

1.1 病毒和細胞

IBRV LN01/08強毒株、BVDV毒株、BPIV3毒株、MDBK細胞(中國農業(yè)科學院特產研究所人獸共患病研究室保存)；BRSV病毒(華威特北京生物技術有限公司惠贈)。

1.2 主要試劑和儀器

MEM和DMEM培養(yǎng)基(GIBCO公司)；馬血清和胎牛血清(Hyclone公司)；TPCK處理胰酶(Sigma公司)；DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒(AXYGEN公司)；DNA聚合酶(寶生物科技有限公司)；反轉錄試劑盒(invotrizen生物技術公司)。引物由上海英濰捷基貿易有限公司合成。分析軟件DNAStar。PCR反應儀(Bio-BAD公司)。

1.3 樣品來源

采自安徽、吉林、遼寧和內蒙古4個省、自治區(qū)臨床樣品33份，其中，鼻拭子17份、血清5份、血液11份。

2 方法

2.1 引物的設計與合成

根據GenBank上登錄的IBRV gB基因全序列(登錄號：AJ004801)、BRSV N基因、BVDV 5′-UTR和BPIV3 N基因序列，利用Oligo 6.0軟件設計了4對特異性引物。引物序列如表1。

表1引物序列

Table 1 Primer

2.2 細胞培養(yǎng)和病毒增殖

MDBK細胞用含8%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)和傳代，待細胞長成單層后，用于病毒接種。取-70℃保存的BPIV3、BVDV及IBRV，接種單層MDBK細胞進行培養(yǎng)，待90%細胞產生明顯細胞病變(CPE)時收獲。反復凍融3次，收獲病毒。

2.3 病毒總RNA的提取

分別吸取反復凍融的BRSV、BPIV3和BVDV病毒液500μL，Trizol法提取病毒總RNA，反轉錄后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 病毒DNA提取

取反復凍融的IBRV病毒液500μL，煮沸10min，8 000r/min離心5min，取上清液留存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 PCR引物的特異性及反應條件優(yōu)化

2.5.1IBRV、BVDV、BRSV及BPIV3(RT)PCR反應條件的建立分別用IBRV、BVDV、BRSV及BPIV3模板和對應引物對進行PCR反應，總體系為：25μL，即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，模板2μL，補充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃～60℃ 15s，68℃ 1min，30個循環(huán)，68℃總延伸10min。

2.5.2引物的特異性反應總系為25μL，即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，引物對1μL，DNA模板2μL，補充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃ 15s，68℃ 1min，30個循環(huán)，68℃延伸10min。擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測。反應體系中模板和引物見表2。

表2引物及模板

Table 2 Primer and template

注：+．體系中含有的模板；-．體系中不含的模板

Note:+．shows template positive;-．shows template negative

2.6 PCR敏感性鑒定

分別以不同濃度的IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽性對照重組質粒為模板，進行多重PCR檢測試劑盒的敏感性實驗，其中，IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽性對照重組質粒的檢測濃度分別為10ng/μL～1.0pg/μL、10ng/μL～100pg/μL、10ng/μL～10pg/μL、10ng/μL～10pg/μL。

2.7 多重PCR檢測方法的建立

建立IBRV PCR檢測方法后，在反應體系中加入BIPV3模板和引物后，優(yōu)化反應條件，建立BIPV3+IBRV 2重PCR方法；在此基礎上同理建立BIPV3+IBRV+BRSV 3重PCR方法及BIPV3+IBRV+BRSV+BVDV多重PCR檢測方法。多重PCR反應體系為25μL。即DNA聚合酶0.5μL，2×Buffer 12.5μL，引物P1～P8各0.5μL，反轉錄模板1.5μL，病毒DNA模板0.5μL，補充滅菌雙蒸水至25μL。PCR條件：98℃ 2min；98℃ 10s，57℃ 15s，68℃ 1min，30個循環(huán)，68℃延伸10min。擴增產物1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)檢測。

2.8 PCR產物的測序分析

將PCR產物連接到pMD18-T載體上，再轉化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細胞中，得到重組菌，提取質粒進行PCR鑒定后陽性菌液測序。

2.9 多重PCR方法臨床樣品檢測

來自臨床的33份樣品，提取總RNA后反轉錄和提取DNA共同作為模板進行多重PCR檢測。

3 結果

3.1 PCR引物的特異性鑒定

分別以IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽性對照重組質粒、組織提取物以及陰性對照(蒸餾水)為模板，進行多重PCR檢測引物的特異性。結果出現對應的306bp、600bp、130bp和422bp條帶，所有的陰性對照均未擴增出任何條帶；3種混合后的樣品加非特異引物則出現特異性引物相對應的條帶，陰性對照(蒸餾水)則未擴增出任何條帶。見圖1和圖2。

1-a.IBRV PCR擴增結果；1-b.BRSV、BVDV、BPIV3 RT-PCR結果；M.DL2 000Marker

1-a.IBRV;1-b.BRSV,BVDV,BPIV3;M.DL2 000Marke

圖1IBRV、BVDV、BPIV3和BRSVPCR結果

Fig.1PCRresultsofIBRV，BVDV，BPIV3andBRSV

3.2 PCR引物檢測的敏感性實驗

分別以不同濃度的IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽性對照重組質粒為模板，進行多重PCR檢測的敏感性實驗。實驗結果顯示，IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3陽性對照重組質粒最低檢測濃度分別為1.0pg/μL、100pg/μL、10pg/μL、10pg/μL，見圖3。

1.DNA MARker2 000；2.IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3混合模板及對應引物多重PCR檢測結果；3.IBRV陽性對照；4.IBRV引物及BRSV、BVDV和BPIV3混合模板PCR檢測結果；5.BRSV陽性對照；6.BRSV引物及IBRV、BVDV和BPIV3混合模板PCR檢測結果；7.BVDV陽性對照；8.BVDV引物及IBRV、BRSV和BPIV3混合模板PCR檢測結果；9.BPIV3陽性對照；10.BPIV3引物及IBRV、BVDV和BRSV混合模板PCR檢測結果；11.蒸餾水對照

1.DNA MARker2 000;2.multiplex PCR result of IBRV、BRSV、BVDV and BPIV3;3.IBRV positive control;4.BRSV、BVDV and BPIV3 templates with IBRV primer;5.BRSV positive control;6.IBRV，BVDV and BPIV3 templates with BRSV primer;7.BVDV positive control;8.BRSV,IBRV and BPIV3 templates with BVDV primer;9.BPIV3 positive control;10.BRSV,IBRV and BVDV templates with BPIV3 primer;11.negative control

圖2引物特異性檢測結果

Fig.2Specificitytestresult

3.3 多重PCR檢測方法的建立

同一體系中同時加入IBRV、BRSV、BVDV及BPIV3 4種模板及對應引物，經反應條件優(yōu)化，建立了2重、3重及多重PCR檢測方法。結果見圖4。

3.4 多重PCR方法臨床樣品檢測結果

利用本研究建立的多重PCR檢測方法檢測33例臨床樣品結果表明，合并感染2種病毒較為多見，分別為BVDV和BRSV共感染、BPIV3和BRSV共感染、BPIV3和IBRV共感染。3種以上病毒混合感染未見(圖5)。

圖3 多重PCR引物檢測的敏感性實驗結果

M.MarkerDL2 000；1.IBRV和BPIV3 2重PCR檢測結果；2.IBRV、BRSV、BVDV和BPIV3多重PCR檢測結果；3.IBRV、BRSV和BPIV3 3重PCR檢測結果

M.MarkerDL2 000;1.Duplex PCR result of IBRV and BPIV3;2.multiplex PCR result of IBRV,BRSV,BVDV and BPIV3;3.triplex PCR result of IBRV,BRSV and BPIV3

圖4多重PCR檢測結果

Fig.4MultiplexPCRresult

a.BVDV和BRSV混合感染、BPIV3和IBRV混合感染；b.IBRV單純感染；c.IBRV單純感染，BVDV單純感染，BRSV與BVDV混合感染a.BVDV and BRSV mixed infection,BPIV3 and IBRV mixed infection;b.IBRV infection;c.IBRV infection,BVDV infection,BRSV and BVDV mixed infection

4 討論

牛呼吸道疾病綜合征是與牛呼吸道疾病相關的最嚴重的疾病。通過檢測可知，臨床上BVDV、BPIV3、BRSV和IBRV共感染現象最常見。所以快速、特異性檢測對確定疾病的病原體和控制疾病的發(fā)生十分關鍵。目前有很多分子檢測方法用于檢測病毒，然而，大多數的方法是檢測單一病原的PCR或實時定量PCR，而且對研究設備的要求更高[7，8]；多重PCR比常規(guī)PCR具有明顯的優(yōu)越性，如更高的敏感性、特異性和高通量的檢測，更重要的是，其檢測快速且對設備要求較低，可應用于普通實驗室。本試驗設計4對引物用于4種病毒序列的擴增，對反應的特異性和敏感性要求更高。雖然RNA病毒是高度可變的，但病毒基因組的保守區(qū)域均可以在BRSV、BPIV3和BVDV病毒基因組中發(fā)現；IBRV病毒屬DNA病毒，基因組相對穩(wěn)定，變異性小。實驗對每個引物的特異性進行了驗證，它可以檢測4種病毒中的每個病原體，與其他病毒均無交叉反應，確保了多重PCR方法的準確性。

國內、外學者建立了BPIV3和BVDV 2重，BVDV、BRSV和BPIV3 3重PCR檢測方法[9]。BRSV、BPIV3和BVDV 3種病毒均為RNA病毒，并且基因組中GC含量在均一水平，給同一體系內同時鑒定提供了便利條件。由于IBRV是DNA病毒，其基因組GC含量高達72%，遠高于其它3種病毒，給PCR鑒定帶來一定的困難。在本研究中，通過條件的優(yōu)化和反應試劑的篩選，成功建立了同一反應體系同時檢測IBRV、BVDV、BPIV3和BRSV 4種病毒的多重PCR檢測方法，克服了基因組本身對反應條件的影響，突破了IBRV不能同時與BVDV、BPIV3和BRSV 3種病毒在同一體系內反應的技術瓶頸，該方法在爆發(fā)牛呼吸道疾病時臨床快速檢測與BRDC流行病學研究具有實際意義。

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