王志鵬 張艷 王曉青

(清華大學(xué)化學(xué)系 北京100084)

對血紅蛋白可逆載氧的系統(tǒng)研究是生物無機化學(xué)領(lǐng)域的重要成果之一，其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系也一直是相關(guān)教學(xué)關(guān)注的重點。在近一個世紀(jì)以來的研究中，人們對于血紅蛋白的分子結(jié)構(gòu)、載氧機理與生物學(xué)功能都有了較為全面的認(rèn)識;但是對于其活性中心血紅素在結(jié)合氧分子前后的相關(guān)結(jié)構(gòu)變化，目前仍然存在多種爭議，其中包括:血紅素中心的亞鐵離子在和氧分子結(jié)合的過程中是否發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移?氧分子與血紅素鐵是端配位還是側(cè)配位?在脫氧狀態(tài)下是否有水分子占據(jù)第6個配位點?本文結(jié)合研究進展對這些爭議進行總結(jié)分析，以期加深對血紅蛋白結(jié)構(gòu)功能的理解，輔助教學(xué)內(nèi)容，并對血紅素類功能配合物的設(shè)計合成提供參考。

1 血紅素的結(jié)構(gòu)與功能

血紅蛋白在高等動物體內(nèi)起運載氧氣的作用。血紅蛋白［1］具有的四級結(jié)構(gòu)為4個亞基構(gòu)成的異源四聚體α2β2，其中每個蛋白亞基都結(jié)合一個血紅素輔基，且將其包裹于蛋白側(cè)鏈構(gòu)成的疏水核心(圖1)。

圖1 血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)圖

脫氧狀態(tài)的血紅素分子由卟啉與亞鐵離子配位形成。雖然不同血紅素分子的卟啉環(huán)外衍生結(jié)構(gòu)不同，可以分為多種異構(gòu)體，但其利用環(huán)上4個氮原子進行配位的方式是一致的。同時，蛋白中87位(α亞基)或92位(β亞基)的組氨酸殘基上的咪唑氮原子從卟啉環(huán)平面上方與亞鐵離子配位，構(gòu)成第5配位點(圖2)。

圖2 血紅蛋白核心結(jié)構(gòu)——血紅素鐵的配位情況示意圖

實驗證明，在脫氧血紅素中，亞鐵離子半徑較大(92pm)，不能嵌入卟啉環(huán)內(nèi)，因而高出卟啉環(huán)平面60pm。當(dāng)氧分子配位后，中心鐵離子半徑縮小至75pm而進入卟啉環(huán)平面。在結(jié)合氧分子過程中還伴隨著中心鐵離子的磁矩變化。在脫氧狀態(tài)下，血紅素鐵呈現(xiàn)順磁性;而在氧合狀態(tài)下呈反磁性［1］。

對于血紅素氧合前后鐵離子半徑和磁性變化的原因存在多種爭議，其中血紅素中心亞鐵離子在氧合過程中是否發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移是最重要的一個。穆斯堡爾譜(M?ssbauer spectroscopy)只顯示中心鐵離子與氧分子之間有強的共價作用，但是難以對鐵離子的氧化態(tài)進行清楚的說明［2］。另外，IR譜中觀察到的O—O鍵的紅外伸縮振動頻率在數(shù)據(jù)與結(jié)論上都存在分歧［3］，但是明確的一點是O—O鍵的鍵級為1.5，與超氧負離子的鍵級相同［4］。Raman光譜也提供了一些數(shù)據(jù)［5］。不過由于中心鐵離子與氧分子配位前后的原子軌道、分子軌道發(fā)生重組，光譜數(shù)據(jù)以及鍵級、鍵長、鍵角等數(shù)據(jù)自然會發(fā)生變化。在沒有直接證據(jù)的情況下，直接對比配位前后的相關(guān)性質(zhì)和譜學(xué)數(shù)據(jù)，從而得出支持某種假設(shè)的結(jié)論是不夠充分可靠的［6］。

另外還有兩個爭議，一是與鐵離子相結(jié)合的氧分子的配位方式，即是端配還是側(cè)配;二是脫氧血紅素中亞鐵離子是5配位，還是有水分子配位形成6配位。人們提出了不同的氧合理論模型，試圖對以上爭論進行解釋。

2 理論模型研究

由于以上實驗證據(jù)表明在脫氧血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)檠鹾涎t蛋白過程中存在某些復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變化和電子重排過程，人們對血紅素中鐵氧鍵合過程和結(jié)構(gòu)提出了多種理論模型。

最早，Pauling運用經(jīng)典價鍵理論建立模型［7-9］對此過程進行說明:O2以端配方式與亞鐵離子結(jié)合，其中一個氧原子的一對孤對電子與鐵配位，未發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，亞鐵離子由5配位高自旋狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)?配位低自旋，因而半徑縮小，由于電子配對，順磁性轉(zhuǎn)變?yōu)榉创判?。血紅素與一氧化碳結(jié)合的產(chǎn)物具有相似的分子結(jié)構(gòu)，可以說明血紅素氧合后的配合物存在一種共振體，因而亞鐵-氧之間的鍵有部分雙鍵性質(zhì)(圖3a)。

后來，Weiss提出電子轉(zhuǎn)移模型［10-11］，認(rèn)為在血紅素與雙氧結(jié)合后，中心的亞鐵離子Fe(Ⅱ)首先轉(zhuǎn)移一個電子給O2形成超氧負離子，自身變成半徑較小的高鐵離子Fe(Ⅲ)，然后超氧負離子與高鐵離子配位。雖然低自旋的高鐵離子有一個未成對電子，本身呈順磁性，但是與同樣具有一個未成對電子的超氧負離子配位結(jié)合后，電子配對，各自的順磁性消失，整體顯示抗磁性(圖3b)。

除此之外，Griffith還提出另外一個側(cè)配氧合模型［12］。他通過對中心原子鐵及氧分子的軌道計算得出，其配位模式既不是垂直端配共振體，也不是傾斜端配共振體。結(jié)合自旋狀態(tài)分析，他認(rèn)為O2是平行于卟啉-鐵配位平面進行配位的，即側(cè)配氧合，利用亞鐵離子空的d2sp3雜化軌道和O2的π2p軌道重疊形成σ鍵，而亞鐵離子的3dxz原子軌道上的電子可以和O2的軌道形成反饋π鍵(圖3c)。

圖3 氧合血紅素的多種理論模型

綜上，現(xiàn)在存在3種不同理論模型，下面對幾個爭議分別進行論述。

3 爭議一:氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)問題

首先，對于結(jié)合雙氧前后血紅素中心亞鐵離子氧化態(tài)的變化情況長期存在爭議。

對公認(rèn)的磁性與半徑變化的事實，Pauling理論解釋為Fe(Ⅱ)離子的電子自旋狀態(tài)的改變，這與鍵長、鍵角等數(shù)據(jù)也相符合［13］;Weiss模型則認(rèn)為鐵(Ⅱ)被氧化為鐵(Ⅲ)，而不僅僅是電子自旋狀態(tài)的變化。中心原子氧化態(tài)的升高必然伴隨著半徑的減小和磁性的改變。前文提到在IR譜中觀察到O—O鍵的紅外伸縮振動頻率對應(yīng)著O—O鍵的鍵級為1.5，與超氧負離子的鍵級相同［14］。此外，X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy)研究表明，中心鐵原子具有一個約為3.2的氧化態(tài)［15］。Durham等人［6］利用X射線吸收近邊結(jié)構(gòu)光譜(X-ray absorption near edge structures)研究中心鐵離子在氧合過程前后的能級變化情況，證明鐵離子在氧合后有效正電荷增加了。這些都能夠被Weiss模型合理地解釋。

對于Pauling模型存在一些困惑。比如通過高自旋到低自旋的轉(zhuǎn)變看似能夠解釋磁性的變化，但是這同時要求氧分子首先由兩個電子自旋平行的三線態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樽孕鋵Φ膯尉€態(tài)，這是一個能量上不利的過程。同時，在Pauling理論中，認(rèn)為氧配位之后使八面體場的晶體場分裂能升高，從而導(dǎo)致中心亞鐵離子由順磁性的高自旋()轉(zhuǎn)變?yōu)榭勾判缘牡妥孕?)，進而使其半徑減小。在這個推理過程中，配位場分裂能的變化，以及高低自旋的轉(zhuǎn)變對半徑的影響，是缺乏直接量化證據(jù)的。相比之下，Weiss模型中亞鐵離子轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F離子，離子半徑自然減小的解釋更加直接有力。

但是，目前對Weiss模型最大的非議是典型的高鐵血紅素卻不具備可逆載氧功能。對于這一點，我們認(rèn)為可以這樣解釋，一是因為在Weiss模型中，與鐵離子配位的實際上是超氧負離子，而不是空氣中直接存在的雙氧分子。故而，這一點不能作為否定Weiss模型的證據(jù)。另外，實驗［16］表明，從血紅蛋白中分離出的血紅素暴露在氧氣中時，氧分子會與兩個血紅素鐵以橋配配位，形成穩(wěn)定的Fe(Ⅲ)-O2-Fe(Ⅲ)產(chǎn)物，血紅素亞鐵被不可逆地氧化為血紅素高鐵。同時，珠蛋白鏈形成的疏水結(jié)構(gòu)可以保護血紅素亞鐵在可逆載氧過程中不被氧化，這已被公認(rèn)。因此我們可以認(rèn)為，在Weiss模型中，從血紅素亞鐵離子到氧分子的一個電子轉(zhuǎn)移只發(fā)生在氧合配位體中，而且是可逆的。在脫氧過程中，受到外圍蛋白結(jié)構(gòu)的保護，氧合配位體脫掉氧分子，血紅素恢復(fù)為亞鐵離子。可見，Weiss模型可以較為合理地解釋現(xiàn)有大部分現(xiàn)象而沒有明顯不合理之處。

氧合血紅素中鐵離子的氧化態(tài)之爭在教學(xué)體系中是非常分明的，因為涉及血紅蛋白的可逆載氧的氧合機理是非常重要的。歷史上Pauling模型有著廣泛的影響，目前國內(nèi)外很多經(jīng)典教科書中都認(rèn)同這一觀點。例如，Miessler［17］在《Inorganic Chemistry》中闡述血紅蛋白的存在可以保護血紅素鐵使其與氧氣結(jié)合后仍保持Fe(Ⅱ)形式，而不被氧化為Fe(Ⅲ)。麥松威［18］在《高等無機結(jié)構(gòu)化學(xué)》中也強調(diào)了在血紅蛋白中，O2結(jié)合于Fe(Ⅱ)，不會氧化為Fe(Ⅲ)。隨著一些新的譜學(xué)實驗的研究，Weiss模型也得到越來越多的支持。Cotton［19］在《Advancd Inorganic Chemistry》中也提到，在脫氧條件下血紅素鐵是Fe(Ⅱ)高自旋;氧合后變?yōu)镕e(Ⅲ)低自旋，通過與超氧負離子結(jié)合而電子配對呈現(xiàn)反磁性。郭子建等在其《生物無機化學(xué)》教材［15］中支持氧合過程中的Weiss模型。

4 爭議二:雙氧配位方式

關(guān)于O2對于鐵離子的配位是彎曲型端配(bent end-on)還是側(cè)配(side-on)也一直存有爭議。在Griffith模型中，O2與血紅素中心鐵原子配位方式為側(cè)配;而在Pauling模型［7-9］和Weiss模型［10-11］中，O2以彎曲型端配方式與鐵結(jié)合。模型化合物和血紅蛋白、肌紅蛋白的X射線晶體衍射數(shù)據(jù)都證實雙氧與鐵離子以端配方式結(jié)合且有一定傾斜角。而M?ssbauer譜也證明O2既不是平行也不是垂直于血紅素平面。

最初因難以獲得準(zhǔn)確的蛋白晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，一系列與血紅蛋白復(fù)合體幾何構(gòu)型相似的模型化合物被構(gòu)建用來研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系［20］。血紅蛋白中氧氣對鐵的彎曲型端配結(jié)構(gòu)最早在尖樁籬笆型復(fù)合體(“picket fence”complex)(圖4)中被觀測到［21-22］，后來人們在氧合肌紅蛋白［23］及氧合血紅蛋白［24］的晶體結(jié)構(gòu)中也觀察到了這種配位方式(圖5)。氧合血紅素中的Fe—O—O鍵在不同物種的同源蛋白質(zhì)及模型化合物中有特定角度，F(xiàn)e—O—O鍵的鍵角在Fe(TpivPP)(2-Melm)尖樁籬笆型復(fù)合物中為129°;在氧合無脊椎動物血紅蛋白中為170°，近乎為直線型［25］;在脊椎動物氧合肌紅蛋白中為115°［26］;在脊椎動物氧合血紅蛋白中為156°，介于尖樁籬笆型復(fù)合物和無脊椎動物血紅蛋白之間。

蛋白空腔的大小、雙氧與蛋白上特定氨基酸之間氫鍵的形成會影響Fe—O—O鍵角。例如，根據(jù)空間位置判斷，氧合血紅蛋白和氧合肌紅蛋白中α-亞基E7位的組氨酸上的Nε與O的間距是2.7?，有利于形成Nε—H┈O的氫鍵，氫鍵的強弱、α-亞基E7位組氨酸與雙氧的相對位置將影響Fe—O—O鍵角。

5 爭議三:鐵離子配位數(shù)問題

圖4 尖樁籬笆型鐵卟啉與雙氧以彎曲型端配方式結(jié)合［21-22］Fe(TpivPP)(2-Melm)(R1=CH3，R2=H)

圖5 氧合血紅蛋白和氧合肌紅蛋白的α-亞基實線表示氧合血紅蛋白，虛線表示氧合肌紅蛋白［24］

在氧合血紅蛋白中，血紅素鐵形成6配位結(jié)構(gòu)，而且CO、NO等小分子極易取代O2與血紅素鐵形成彎型端配結(jié)構(gòu)［27］。在生物體的脫氧血紅蛋白中，水是否與血紅素鐵配位也小有爭議。大部分教材描述脫氧血紅蛋白中亞鐵離子為5配位，因為血紅素所處的疏水蛋白結(jié)構(gòu)應(yīng)不利于水的配位結(jié)合;但也有研究［28］報告在脫氧血紅蛋白中，水分子可以作為血紅素鐵的軸向配體參與配位，即在脫氧情況下血紅素鐵為6配位。如果血紅素鐵在氧合前后都是6配位，即只是水分子被氧分子取代，則很難解釋血紅素鐵在氧合過程中的巨大結(jié)構(gòu)變化。對于水分子與血紅素鐵的配位情況，目前所得的血紅蛋白及血紅素模型化合物的晶體結(jié)構(gòu)顯示很少有水參與中心金屬的配位［19］。但Priedman等人［29］在研究Scapharca的二聚血紅蛋白結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，在此血紅蛋白亞基界面上有水分子團簇結(jié)構(gòu)。根據(jù)二聚血紅蛋白晶體結(jié)構(gòu)，脫氧二聚血紅蛋白的血紅素鐵可與水分子配位。他們用定點突變、改變滲透壓的方法進一步研究水分子配位對血紅蛋白功能的影響，發(fā)現(xiàn)將Scapharca血紅蛋白的72位蘇氨酸突變?yōu)槔i氨酸后，氧氣對血紅蛋白的親和性提高了40倍;造成這一結(jié)果的最重要差異就是:突變后血紅蛋白中的血紅素鐵與水分子的結(jié)合能力變?nèi)趿?。此外，增加滲透壓將降低人血紅蛋白對氧氣的親和性，這說明水分子和氧氣在與血紅素鐵配位時存在競爭關(guān)系，人血紅蛋白中血紅素鐵可能與水分子存在類似的弱配位鍵。

綜上所述，目前只在極少數(shù)血紅蛋白晶體中觀察到了水與血紅素鐵的配位。一般認(rèn)為，脫氧時血紅素鐵為5配位，即血紅素鐵不與水分子配位。

6 結(jié)論

對于血紅蛋白中血紅素的氧合過程及氧合前后的結(jié)構(gòu)變化，人們采用了多種物理和化學(xué)手段進行研究，獲得了豐富的數(shù)據(jù)?；诖耍藗兲岢隽薖auling模型、Weiss模型等不同的理論模型試圖解釋血紅蛋白的氧合機理，但是對其具體結(jié)構(gòu)某些方面的認(rèn)識仍然存在一些爭議。本文通過分析比較幾種理論模型，結(jié)合相關(guān)研究的最新進展，對目前教學(xué)中有爭議的問題進行了梳理和總結(jié)，提出相關(guān)看法。對于氧合過程中鐵離子的氧化態(tài)問題，我們認(rèn)為Weiss理論中Fe(Ⅲ)與超氧負離子的配位模型比較合理;對于O2配位方式的爭議，目前已基本解決，晶體結(jié)構(gòu)表明其為彎曲型的端配;對于脫氧血紅素中鐵離子的配位數(shù)其實爭議不大，均認(rèn)為是5配位。但某些研究表明在脫氧情況下，一些物種的血紅素鐵可與水、組氨酸和卟啉環(huán)形成6配位結(jié)構(gòu)，值得關(guān)注。

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