吳 珺，張 潔,，邵科峰，陳昌云，王傳現(xiàn)，趙 波,

（1.南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.上海出入境檢驗(yàn)檢疫局，上海 200135）

沙丁胺醇又名1-（4-羥基-3-羥甲基苯基）-2-（叔丁氨基）乙醇，其結(jié)構(gòu)式見圖1。沙丁胺醇是β-激動(dòng)劑系列的一種，對(duì)治療哮喘有一定的作用。沙丁胺醇也可以促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的速率，同時(shí)能增加瘦肉的產(chǎn)量[1-3]，因此被不法分子添加到動(dòng)物的飼料中。但是人類在食用含沙丁胺醇的肉制品時(shí)，沙丁胺醇會(huì)在人體內(nèi)富集。沙丁胺醇會(huì)產(chǎn)生肌肉顫抖、心悸、頭痛、肌肉疼痛、惡心、嘔吐、發(fā)燒等副作用[4-6]?；谝陨显?，中國(guó)和許多歐洲國(guó)家都已經(jīng)明令禁止使用沙丁胺醇等β-激動(dòng)劑系列[7]。

目前，食品中β-激動(dòng)劑的檢測(cè)方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及酶聯(lián)免疫法[8-17]，這些方法都具有前處理復(fù)雜，價(jià)格昂貴以及攜帶不方便等缺點(diǎn)。免疫生物傳感器是利用生物活性物質(zhì)的專一識(shí)別功能，有選擇地檢測(cè)待測(cè)物。以靈敏度高、選擇性好、分離過程和檢測(cè)技術(shù)合為一體、不需要樣品預(yù)處理或簡(jiǎn)單處理便能直接應(yīng)用于復(fù)雜樣品的檢測(cè)等特點(diǎn)而受到廣泛重視，成為臨床、生物醫(yī)藥、環(huán)境化學(xué)以及食品安全分析中一種有力的分析手段。納米材料因其具有獨(dú)特的電子特性和表面微結(jié)構(gòu)，較大的比表面積、較高的表面活性、強(qiáng)吸附力、較高催化效率以及良好的生物相容性等優(yōu)異特性[18-19]，可在增加生物分子（酶、抗原或抗體等）[20-23]的吸附量和穩(wěn)定性的同時(shí)提高生物分子的催化活性，很好地促進(jìn)生物電活性分子的電子傳遞，使傳感器或納米免疫分析的響應(yīng)靈敏度大大提高，成為現(xiàn)代化學(xué)分析的重要發(fā)展方向之一。

納米金具有大的比表面積，優(yōu)異的光學(xué)性能以及良好的生物兼容性而被廣泛用于電化學(xué)傳感器[24-26]，并且其具有良好的導(dǎo)電性，能有效提高電子的傳輸。石墨烯作為一種具有二維結(jié)構(gòu)的新型碳基材料，因其具有更大的比表面積及高電子傳導(dǎo)能力、原料易得且價(jià)格便宜等優(yōu)點(diǎn)，已成為繼碳納米管后新一代的理想電極修飾材料。本實(shí)驗(yàn)將納米技術(shù)和免疫分析方法有機(jī)結(jié)合，研究開發(fā)了一種高靈敏、高選擇性、低成本、快速現(xiàn)場(chǎng)的新型多殘留復(fù)合納米免疫分析檢測(cè)技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)旨在發(fā)展β-激動(dòng)劑類獸類藥物殘留技術(shù)的創(chuàng)新提供參考，為我國(guó)β-激動(dòng)劑類獸殘檢測(cè)和監(jiān)管作出貢獻(xiàn)，同時(shí)也可為其他農(nóng)獸殘檢測(cè)提供一種先進(jìn)的通用技術(shù)，具有很大的社會(huì)效益和應(yīng)用價(jià)值。

圖1 沙丁胺醇結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of salbutamol

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙丁胺醇 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；沙丁胺醇抗體深圳華英生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；氯金酸 南京化學(xué)試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4）由0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4溶液按一定比例配得；提取液是乙腈與丙酮以4∶1的體積比配得。其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI852C電化學(xué)工作站、三電極體系（工作電極為玻碳電極，對(duì)電極為鉑電極，參比電極為Ag/AgCl電極） 上海辰華儀器有限公司；PHS-25型pH計(jì) 上海今邁儀器儀表有限公司；UV1700PC紫外-可見分光光度計(jì) 上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；FA1004分析天平 上海良平儀器儀表有限公司；JSM-7600F高分辨熱場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 日本電子株式會(huì)社。

1.3 方法

1.3.1 石墨烯懸濁液的制備

1.3.1.1 氧化石墨烯制備

將50 mL濃H2SO4、10 g K2S2O8、10 g P2O5混合，將12 g石墨粉加入到上述混合液中，反應(yīng)6 h。加入2 L水，過夜。將460 mL濃H2SO4冰箱冰凍處理備用，將氧化的石墨粉加入到濃H2SO4中攪拌。溫度控制在10 ℃以下，緩慢加入60 g KMnO4，混合物在35 ℃反應(yīng)2 h，緩慢加入920 mL去離子水，保持50 ℃以下，攪拌反應(yīng)2 h。加入2.8 L水以及50 mL 30% H2O2，攪拌反應(yīng)1 d。使用5 L 10%的HCl溶液沖洗，離心。然后再用5 L水洗，至溶液呈中性。

1.3.1.2 石墨烯的制備

稱取上述氧化石墨0.05 g，加入到100 mL pH 11的NaOH溶液中；150 W超聲90 min制備氧化石墨烯分散液；在4 000 r/min離心3 min除去極少量未剝離的氧化石墨；向離心后的氧化石墨烯分散液中加入0.1 mL水合肼，在90 ℃攪拌反應(yīng)2 h，得到石墨烯分散液。

1.3.1.3 石墨烯懸濁液的制備

稱取10 mg的石墨烯于10 mL離心管中，加入4 mL的二次蒸餾水，超聲使其分散均勻，制得石墨烯懸濁液，放入4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.3.2 電極的制備

將玻碳電極GCE（Φ=3 mm）在1.0 μm和0.3 μm Al2O3拋光粉上拋光成鏡面，并分別在二次蒸餾水、乙醇與二次蒸餾水混合液、二次蒸餾水中清洗干凈，室溫晾干，備用。

1.3.3 紫外-可見光譜的測(cè)定

1.3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.005 g沙丁胺醇，溶于10 mL無水乙醇中，配得0.5 g/L的沙丁胺醇溶液。用無水乙醇對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行稀釋，得到0.01 g/L的沙丁胺醇溶液。以無水乙醇為參比液，對(duì)0.01 g/L的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.3.3.2 石墨烯-沙丁胺醇復(fù)合物以及石墨烯懸浮液的制備

先將石英片清洗干凈，晾干，然后取制備好的石墨烯懸濁液300 μL和150 μL的質(zhì)量濃度為0.1 g/L的沙丁胺醇混合后滴加到石英片上，并在40 ℃烘干。待烘干后用5%的牛血清白蛋白封閉活性位點(diǎn)。最后用磷酸緩沖溶液沖洗，室溫晾干。

同樣樣取300 μL的石墨烯滴加到石英片上，其他步驟同上。

將前面得到的固體刮下，置于10 mL的離心管中，加入9 mL的去離子水，超聲使其均勻分散。

1.3.3.3 紫外-可見光譜的測(cè)定

以去離子水為參比液，對(duì)上述得到的兩種分散液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

1.3.4 電化學(xué)表征

將清洗干凈備用的玻碳電極沉積納米金，在100 mg/L的HAuCl4溶液中在－0.2 V電勢(shì)下恒電位60 s，取4 μL石墨烯懸濁液和2 μL 0.1 g/L的沙丁胺醇溶液的混合液滴涂于鍍金后的玻碳電極上，室溫晾干。最后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛血清白蛋白封閉活性位點(diǎn)。

利用循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）研究了不同修飾電極的電化學(xué)行為，電位范圍為－0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s；運(yùn)用差分脈沖伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）對(duì)孵育時(shí)間、抗體用量進(jìn)行了優(yōu)化，電位掃描范圍在－0.2～0.5 V，脈沖幅度為50 mV，脈沖寬度為50 ms，并在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下運(yùn)用DPV進(jìn)行線性范圍測(cè)定、樣品回收率測(cè)定。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)原理見圖2。

圖2 納米金-石墨烯復(fù)合物修飾電極的免疫傳感器檢測(cè)沙丁胺醇的原理Fig.2 Principle of the modified immunosensor for salbutamol detection

1.3.5 樣品的前處理

稱?。?±0.005 0） g實(shí)際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）于10 mL的樣品管中，加入沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液和3 mL乙腈-丙酮提取液（V（乙腈）∶V（丙酮）=4∶1），混合物超聲振蕩30 min，于2 000 r/min離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至氮吹管中，殘?jiān)? mL的相同提取液重復(fù)提取1 次，上清液合并在氮吹管中。提取物在氮吹條件下濃縮蒸發(fā)，濃縮物加入1 mL的pH 7.4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜

圖3 電極表面修飾材料紫外-可見光譜Fig.3 Ultraviolet-visible spectra of surface-modifying materials

取0.01 g/L的沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液，以無水乙醇為參比液，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到其在226 nm波長(zhǎng)處有吸收峰，吸光度為0.469。見圖3曲線a。以去離子水為參比液，對(duì)石墨烯及石墨烯-沙丁胺醇的分散液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，圖3曲線b、c，可以知道，石墨烯在226.5 nm波長(zhǎng)處沒有吸收峰，而石墨烯-沙丁胺醇的混合液在226.5 nm波長(zhǎng)處有紫外吸收峰（峰值為0.310），因此石墨烯-沙丁胺醇混合液表現(xiàn)出沙丁胺醇的性質(zhì)。

2.2 納米金和石墨烯的掃描電鏡分析

圖4 掃描電鏡圖Fig.4 SEM images

從圖4A可以看出，納米金均勻的分散在電極表面，尺寸在50～400 nm之間。從圖4B可以看出，石墨烯呈很薄的片狀。石墨烯由一層密集的、包裹在蜂巢晶體點(diǎn)陣上的碳原子組成，是世界上最薄的二維材料，其厚度僅為0.335 nm。

2.3 修飾電極的電化學(xué)行為

圖5 不同修飾電極的CV曲線圖Fig.5 CV curves of different modified electrodes

將清洗干凈的玻碳電極在2 mmol/L的K3[Fe(CN)6]的PBS溶液中掃描循環(huán)伏安法，電位范圍為－0.2～0.8 V，掃描速率為100 mV/s，圖5曲線a，裸電極具有一堆明顯的可逆的氧化還原峰。再將修飾上石墨烯的玻碳電極以相同參數(shù)掃描循環(huán)伏安法，由于石墨烯具有優(yōu)異的電化學(xué)活性，大的比表面積，突出的導(dǎo)熱性能，增強(qiáng)電子的傳遞，因此峰值會(huì)增大（曲線b）。當(dāng)電極上修飾了納米金-石墨烯-沙丁胺醇后，峰電流明顯增大，如曲線c所示，這是由于納米金顆粒具有良好的生物相容性，高的表面積和導(dǎo)電性，進(jìn)一步增強(qiáng)了電子的傳遞。最后將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極在含量為50 μL的沙丁胺醇單克隆抗體中孵育40 min，由于電極上修飾的沙丁胺醇半抗原和抗體結(jié)合，阻礙了電極傳遞，見曲線d，說明沙丁胺醇半抗原已經(jīng)被固定在電極上。

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 反應(yīng)時(shí)間

不同檢測(cè)條件的影響，如免疫反應(yīng)的時(shí)間對(duì)免疫的影響，分別取0、5、10、15、20、25、30、35 min，利用差分脈沖伏安法（電位掃描范圍－0.2～0.5 V，脈沖幅度50 mV，脈沖寬度50 ms）得時(shí)間與孵育電流之間的關(guān)系，圖6，其中0～35 min之內(nèi)，電流值在逐漸減小，說明抗體和沙丁胺醇特異性結(jié)合，30～35 min之間電流值達(dá)到過飽和狀態(tài)，說明抗體已經(jīng)和沙丁胺醇充分特異性結(jié)合，繼續(xù)增加孵育時(shí)間對(duì)DPV峰電流響應(yīng)沒有明顯的影響。因此選擇30 min為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最優(yōu)時(shí)間。

圖6 孵育時(shí)間對(duì)差分脈沖伏安法電流值的影響Fig.6 Relationship between incubation time and differential pulse voltammetry current

2.4.2 抗體量

圖7 抗體量對(duì)差分脈沖伏安法電流值的影響Fig.7 Relationship between antibody volume and differential pulse voltammetry current

在上述最優(yōu)時(shí)間為30 min條件下，通過改變沙丁胺醇單克隆抗體的體積量，利用差分脈沖伏安法（電位掃描范圍－0.2～0.5 V、脈沖幅度50 mV、脈沖寬度50 ms）得抗體量與孵育電流之間的關(guān)系，見圖7，其中在0～7 μL之間，電流值逐漸降低，這是由于沙丁胺醇和抗體特異性結(jié)合，7～9 μL，電流值基本不變化，說明抗體已經(jīng)基本和沙丁胺醇完全特異性結(jié)合，抗體量基本達(dá)到飽和狀態(tài)，因此以后的實(shí)驗(yàn)中取7 μL為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳抗體量。

2.5 線性范圍和檢測(cè)限

規(guī)定納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極在只含7 μL抗體的PBS緩沖溶液中孵育后的響應(yīng)電流為I0，在含有一定量游離的沙丁胺醇的孵育液孵育后的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加ΔI=Ix－I0。在最優(yōu)化的條件下，測(cè)定了沙丁胺醇質(zhì)量濃度和響應(yīng)電流增加值ΔI的線性關(guān)系，見圖8，隨著溶液中游離的沙丁胺醇質(zhì)量濃度增加，抗體與電極上修飾的沙丁胺醇結(jié)合量越小，導(dǎo)致Ix減小，因此響應(yīng)電流的增加量越大。結(jié)果表明，ΔI與沙丁胺醇質(zhì)量濃度在1×10－6～5×10－3g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為Y=0.767 75+0.002 04X（r=0.972 12），檢測(cè)限為2×10－7g/L。

2.6 修飾電極的重復(fù)和穩(wěn)定性

圖9 修飾電極的重復(fù)性Fig.9 Stability of the modified electrode

對(duì)沙丁胺醇免疫傳感器的重復(fù)性進(jìn)行了研究，將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極重復(fù)11 次差分脈沖伏安法掃描，其峰電流變化相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，見圖9，說明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。

對(duì)免疫傳感器的穩(wěn)定性，將納米金-石墨烯-沙丁胺醇修飾電極存放在PBS中，每天進(jìn)行氧化還原標(biāo)記的差分脈沖伏安法掃描，結(jié)果顯示峰電流在8 d內(nèi)降低值小于10%，見圖10，說明制備的電極穩(wěn)定性較好。

圖10 修飾電極的穩(wěn)定性Fig.10 Repeatability of the modified electrode

2.7 對(duì)實(shí)際樣品的分析

對(duì)4 種加入不同量沙丁胺醇標(biāo)準(zhǔn)液的實(shí)際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)所述的前處理，進(jìn)而進(jìn)行測(cè)定，對(duì)每個(gè)添加量測(cè)定3 次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，沙丁胺醇的回收率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。分析上述回收率總結(jié)得到，牛肉的回收率為92.4%，鴨肉的回收率為91.2%，豬肉的回收率為94.9%，豬肝的回收率為102.2%，其中豬肝的回收率最高。這是由于豬肝是食物排毒代謝的重要器官，沙丁胺醇易于在肝臟內(nèi)聚集，所以具有很高的回收率。由此也可以知道，肝臟中積累有害物質(zhì)的量會(huì)比其他部位要多。

表1 實(shí)際樣品（牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝）加標(biāo)處理測(cè)試沙丁胺醇實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of salbutamol from spiked real samples of beef,pork, duck and pork liver

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了一種新型的符合納米材料的高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器，結(jié)合了納米金具有獨(dú)特的電學(xué)以及良好的生物兼容性，很大的比表面積和很高的催化性能等性質(zhì)以及石墨烯優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大的比表面積，制得了納米金-石墨烯復(fù)合的納米免疫傳感器。將這種納米免疫傳感器應(yīng)用到對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)中，實(shí)驗(yàn)表明其在1×10－6～5×10－3g/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，并且具有超高的靈敏度，即檢測(cè)限為2×10－7g/L，同時(shí)對(duì)牛肉、豬肉、鴨肉和豬肝等實(shí)際樣品進(jìn)行了加標(biāo)回收的實(shí)驗(yàn)，也取得了滿意結(jié)果。實(shí)驗(yàn)也表明，本實(shí)驗(yàn)制備的納米免疫傳感器實(shí)現(xiàn)了對(duì)沙丁胺醇的檢測(cè)，同時(shí)對(duì)實(shí)際樣品也有很高的回收率。

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