鄭 聰，王華東，王慧倩，王 靜，鄭永華

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

草莓果實(shí)柔軟多汁、酸甜可口，同時(shí)富含花青素等多種活性成分，營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛[1]。然而草莓果實(shí)含水量高、組織嬌嫩，采后呼吸代謝旺盛，果實(shí)易發(fā)生軟化、失水萎蔫和腐爛霉變，因而難以貯運(yùn)，常溫條件下放置1～2 d感官品質(zhì)就會(huì)發(fā)生明顯的劣變[2-3]，嚴(yán)重制約了草莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，如何延長草莓果實(shí)的貯藏期已經(jīng)成為急待解決的問題。目前，國內(nèi)較多采用化學(xué)方法保鮮果蔬，該法雖然效果顯著，但也帶來潛在的環(huán)境污染健康危害問題，因此果蔬的化學(xué)保鮮受到了越來越多的質(zhì)疑和限制。

熱處理作為一種安全、有效的果蔬保鮮方法，不僅能有效抑制由微生物引起的果實(shí)腐敗[4]，還能起到延緩果實(shí)衰老和延長貨架期的作用[5]。已有研究表明，熱空氣處理能顯著降低草莓果實(shí)貯藏期間的呼吸強(qiáng)度，維持較高的總酸水平[6]，同時(shí)能有效延緩果實(shí)的軟化，抑制貯藏后期果實(shí)腐爛指數(shù)上升[7]。但熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)活性成分和抗氧化活性影響及其與相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系尚未見報(bào)道。本課題組前期通過響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)45 ℃熱空氣處理3.5 h對(duì)抑制草莓果實(shí)采后腐爛的效果最佳。在本實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步研究熱空氣處理?xiàng)l件對(duì)草莓果實(shí)品質(zhì)、活性成分、抗氧化活性及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期從分子水平探討熱處理對(duì)延緩草莓果實(shí)衰老和調(diào)控營養(yǎng)品質(zhì)的可能機(jī)理，為熱處理在草莓果實(shí)采后保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所用草莓品種為紅艷（Fragaria×ananassaDuch.cv.Hongyan），選擇大小、成熟度基本相同、果形端正、無病蟲害、無機(jī)械傷害的果實(shí)。

無水乙醇、乙酸乙酯、三氯化鐵（均為分析純），甲醇（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鐵氰化鉀、無水氯化鋰 西隴化工股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl，DPPH）、Follin試劑 美國Sigma公司；Tris、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）、亞精胺 北京索萊寶科技有限公司；十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB） 美國Biosharp公司。

GL-20G-H型冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；UV-1600型紫外-可見分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；伯樂PCR擴(kuò)增儀 上海天呈科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 草莓的處理

經(jīng)過前期響應(yīng)面試驗(yàn)，得出熱空氣處理增強(qiáng)草莓抗病性的最佳條件為：45 ℃，3.5 h。將草莓隨機(jī)分為2 組進(jìn)行以下處理：1）不經(jīng)過任何處理，20 ℃恒溫放置3.5 h，作為對(duì)照（CK）；2）45 ℃熱空氣處理3.5 h（HAT）；將各處理組果實(shí)用塑料盒（20 cm×12 cm×8 cm）分裝，每盒30 個(gè)果實(shí)，塑料盒外套0.01 mm厚聚乙烯保鮮袋保濕。隨后將果實(shí)置于（20±1）℃，相對(duì)濕度90%～95%的恒溫箱中貯藏4 d，每天觀察果實(shí)腐爛情況，同時(shí)取樣用液氮速凍并于－20 ℃保存用于測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。每個(gè)處理共150 個(gè)果實(shí)，重復(fù)3 次。

1.2.2 指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 腐爛指數(shù)的測(cè)定

草莓果實(shí)的腐爛指數(shù)參照陳學(xué)紅等[8]的方法測(cè)定。按果實(shí)腐爛面積大小劃分為4 個(gè)級(jí)別：0級(jí)，無腐爛；1級(jí)，腐爛面積占果實(shí)面積小于25%；2級(jí)，腐爛面積占果實(shí)面積的25%～50%；3級(jí)，大于果實(shí)面積50%。按下式計(jì)算腐爛指數(shù)：

1.2.2.2 硬度的測(cè)定

用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定果實(shí)硬度。探頭（SMSP/5）直徑5 mm；下壓距離5 mm；下壓速率1 mm/s。取最大值，每個(gè)果實(shí)分別測(cè)定陰陽面赤道部位，重復(fù)10 次，取平均值。

1.2.2.3 總酚、總黃酮、花青素和VC含量的測(cè)定

總酚含量測(cè)定采用Flion-Ciocalte法[9]，以兒茶酚質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。總黃酮含量的測(cè)定采用裴詠萍等[10]的三氯化鋁法測(cè)定，以顯色液中蘆丁的質(zhì)量（mg）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。花青素含量的測(cè)定采用pH示差法[11]。VC含量用2,6-二氯靛酚法測(cè)定，結(jié)果以mg/100 g表示，以鮮質(zhì)量計(jì)。

1.2.2.4 DPPH自由基清除率和總還原力的測(cè)定

DPPH自由基清除率參照Larrauri等[12]的方法來測(cè)定，結(jié)果以清除百分率來表示。還原力采用Oyaizu[13]的方法來測(cè)定，結(jié)果以三氯化鐵反應(yīng)液在700 nm波長處的吸光度來表示。

1.2.2.5 品質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)

熱空氣處理后的草莓果實(shí)置于20 ℃條件下貯藏，處理完后即刻對(duì)處理組和照組果實(shí)進(jìn)行取樣，取樣時(shí)間為：0、3、6、9、12 h。

運(yùn)用RT-PCR方法研究草莓果實(shí)品質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá)。品質(zhì)相關(guān)基因包括beta xylosidase（FaXyl1）、flavonol synthase（FLS）、anthocyanidin synthase（FaANS）、chalcone synthase（FrCHS）和phenylalanine ammonialyase 6（PAL6）。草莓果實(shí)的總RNA提取參照J(rèn)aakola等[14]的CTAB方法進(jìn)行提取，同時(shí)做了一些修改。液氮中研磨4 g草莓果肉，轉(zhuǎn)移樣品至5 倍體積65 ℃水浴中預(yù)熱的CTAB（含2%巰基乙醇）提取液的離心管中（10 min），期間激烈渦旋，離心取上清。加入等體積的氯仿，離心取上清，重復(fù)提取一次，將上清轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入1/4體積的10 mol/L LiCl，4 ℃條件下沉淀過夜。12 000 r/min、4 ℃離心20 min。沉淀用500 μL SSTE溶液洗，使其充分溶解等體積氯仿抽提2 次，取上清，加入2 倍體積無水乙醇，混勻后－20 ℃沉淀30 min（3 h）以上。12 000 r/min、4 ℃離心20 min，棄上清，干燥，溶于適量DEPC水。待RNA沉淀完全溶解后于－20 ℃保存。用Thermo Nano Drop 2000分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照兩步法RT-PCR程序進(jìn)行。進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)所用的引物序列如下：FaXyll：sense AGCCTACTTGTGCTGACC，antisense GTTTCCTATCATCGTTTCG；FLS：s e n s e T G G A A G- G G A A G A A A G G G T G，a n t i s e n s e G A AT G G T G A G G G C G G A C A；F a A N S：s e n s e T TAT C A A C C A C G G C ATCT，antisense TCTAATCCCAAGCCAAGT；FrCHS3：sense GTCCGTTAAGCGTCTCAT，antisense GGCT-CCGTCACTATCAGG；PAL6：sense GTGAAAGAAGCGAAGAAGG，antisense G A A G C T C G G A G C A G T-AT G；1 8 S r R N A：sense AGCAAGCCTACGCTCTGG，antisense GGTGCCCTTCCGTCAATT。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），用鄧肯多重比較方法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)腐爛的影響

圖1 熱空氣對(duì)草莓果實(shí)腐爛指數(shù)的影響Fig.1 Effect of hot-air treatment on decay index in strawberry fruit

由圖1可知，隨著貯藏時(shí)間的延長，草莓果實(shí)的腐爛指數(shù)呈上升趨勢(shì)，熱空氣處理能顯著抑制草莓果實(shí)的腐爛。在貯藏第4天，對(duì)照草莓果實(shí)腐爛指數(shù)達(dá)到40.9%，而熱處理組僅為23.3%，顯著低于對(duì)照果實(shí)（P＜0.05）。

2.2 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)硬度和β-木糖苷酶（FaXyl1）基因表達(dá)的影響

草莓在貯藏期間果實(shí)的硬度逐漸下降，導(dǎo)致果實(shí)的軟化和貯藏性的下降。熱處理可延緩草莓果實(shí)硬度的下降，在整個(gè)貯藏期中熱處理果實(shí)的硬度顯著高于對(duì)照果實(shí)（P＜0.05）（圖2）。熱空氣處理可顯著抑制草莓果實(shí)中β-木糖苷酶（FaXyl1）基因的表達(dá)，熱處理12 h后FaXyl1基因表達(dá)水平雖然有所回升，但仍明顯低于對(duì)照果實(shí)（圖3）。這表明熱處理能通過抑制β-木糖苷酶基因的表達(dá)，抑制細(xì)胞壁中半纖維素的降解，從而保持草莓果實(shí)的硬度。

圖2 熱空氣對(duì)草莓果實(shí)硬度的影響Fig.2 Effect of hot-air treatment on firmness in strawberry fruit

圖3 熱空氣對(duì)草莓果實(shí)FaXyl1基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of hot-air treatment on expression of FaXyl1 gene in strawberry fruit

2.3 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)總黃酮、總酚、VC和花青素含量的影響

圖4 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)總酚（A）、總黃酮（B）、VC（C）和花青素（D）含量的影響Fig.4 Effect of hot-air treatment on contents of total phenolices (A),total flavonoids (B), VC (C) and anthocyanin (D) in strawberry fruit

由圖4可見，草莓果實(shí)采后總黃酮和VC含量逐漸下降，而總酚和花青素含量呈緩慢上升趨勢(shì)。熱空氣處理可延緩黃酮和VC含量的下降，促進(jìn)總酚的積累。在整個(gè)貯藏期中，熱處理果實(shí)的總黃酮、總酚和VC的含量都顯著高于對(duì)照果實(shí)（P＜0.05），從而維持較高的活性成分含量。但熱空氣處理顯著抑制了草莓果實(shí)中花青素的積累（P＜0.05），經(jīng)4 d貯藏后，對(duì)照果實(shí)的花青素含量達(dá)118.3 mg/100 g，顯著高于處理果實(shí)的104.9 mg/100 g。

2.4 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)酚類等活性成分代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

如圖5所示，熱空氣處理可顯著促進(jìn)草莓果實(shí)中黃酮醇合酶（flavonol synthase，F(xiàn)LS）、查耳酮合酶（chalcone synthase，CHS）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）等黃酮類和酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，而抑制花青素合成酶基因（FaANS）的表達(dá)。這與熱空氣處理能保持較高的總黃酮和總酚含量而抑制花青素在果實(shí)中累積的結(jié)果（圖4D）一致。

圖5 熱空氣對(duì)草莓果實(shí)活性成分合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of hot-air treatment on expression of genes involved in synthesis of bioactive compounds in strawberry fruit

2.5 熱空氣處理對(duì)草莓果實(shí)DPPH自由基清除能力和總還原力的影響

圖6 熱空氣對(duì)草莓果實(shí)DPPH自由基清除能力（A）和還原力（B）的影響Fig.6 Effect of hot-air treatment on DPPH scavenging activity (A) and reducing activity (B) in strawberry fruit

如圖6所示，草莓果實(shí)在貯藏期間DPPH自由基清除力總體呈上升趨勢(shì)，而還原力則呈下降趨勢(shì)。在整個(gè)貯藏期間，熱空氣處理果實(shí)的DPPH自由基清除力和總還原力都顯著（P＜0.05）高于對(duì)照果實(shí)，這與熱空氣處理能保持較高的黃酮、多酚和VC等抗氧化物質(zhì)含量（圖4）有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

果實(shí)軟化是影響草莓果實(shí)采后貯藏和貨架期的一個(gè)重要因素。草莓果實(shí)軟化主要是由于細(xì)胞壁中的果膠物質(zhì)和半纖維素降解所致[15]。木聚糖是果膠物質(zhì)和半纖維素的重要組分，它在內(nèi)切β-1,4-木糖酶的催化下水解成寡聚木糖，后者再由β-木糖苷酶進(jìn)一步水解產(chǎn)生木糖。研究發(fā)現(xiàn)在草莓果實(shí)成熟軟化過程中，編碼β-木糖苷酶（FaXyl1）基因的mRNA大量積累，并在整個(gè)成熟期保持較高的β-木糖苷酶活性[16-17]。熱處理可以抑制草莓果實(shí)β-木糖苷酶等細(xì)胞壁降解酶的活性，保持較高的果實(shí)硬度[18]，這些結(jié)果說明β-木糖苷酶的作用與草莓果實(shí)的軟化有密切關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)熱空氣處理可顯著抑制草莓果實(shí)中β-木糖苷酶（FaXyl1）基因的表達(dá)，同時(shí)延緩果實(shí)硬度的下降，這進(jìn)一步證實(shí)了β-木糖苷酶在草莓果實(shí)的軟化中起到重要作用。

草莓中富含VC、黃酮類和酚類等生物活性成分[19]，這些活性成分有助于提高草莓果實(shí)的抗氧化能力[20]，其中多酚類物質(zhì)是草莓抗氧化的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[21]。PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一關(guān)鍵酶[22]，與酚類物質(zhì)的合成密切相關(guān)，而FLS和CHS是黃酮類合成的關(guān)鍵酶，其活性高低直接決定黃酮類化合物的積累[23]。在本研究中，熱空氣處理可顯著促進(jìn)PAL6、FrCHS3和FLS基因的表達(dá)，同時(shí)維持果實(shí)中較高的總酚和總黃酮含量。由此可見，熱空氣處理可以通過增強(qiáng)黃酮和多酚類合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，從而提高果實(shí)中這些活性成分的含量。花青素合成酶（anthocyanidin synthase，ANS）是花青素合成的關(guān)鍵酶，但花青素不穩(wěn)定，在熱脅迫下極易降解，導(dǎo)致花青素積累量的下降[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，草莓果實(shí)在貯藏過程中，花青素合成酶基因FaANS大量表達(dá)，花青素不斷積累，草莓果實(shí)顏色變深，而熱空氣處理后的果實(shí)中FaANS基因的表達(dá)水平極低，同時(shí)果實(shí)中花青素積累量顯著低于對(duì)照，可見熱空氣處理通過抑制FaANS基因的表達(dá)，從而抑制了花青素的合成和積累。在本研究中雖然熱處理果實(shí)的花青素含量明顯低于對(duì)照果實(shí)，但由于熱處理能保持較高的黃酮、多酚和VC等抗氧化物質(zhì)含量，因而使處理果實(shí)的抗氧化活性明顯高于對(duì)照果實(shí)。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，熱空氣處理可顯著抑制草莓果實(shí)腐爛的發(fā)生，延緩果實(shí)硬度下降，從而保持果實(shí)的食用品質(zhì)；熱空氣處理可通過促進(jìn)黃酮類和酚類物質(zhì)合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，保持較高的總黃酮和總酚含量，從而提高果實(shí)的抗氧化能力和營養(yǎng)價(jià)值。

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