焦宇知，翟瑋瑋

（1.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2.普渡大學(xué)西拉法葉校區(qū)，美國(guó) 西拉法葉 47907）

冷凍是食品工業(yè)中廣泛使用的食品加工和貯藏方式。在食品后續(xù)加工或運(yùn)輸過(guò)程中，由于環(huán)境變化，冷凍食品極易出現(xiàn)不可控的反復(fù)凍融和重結(jié)晶，從而導(dǎo)致食品發(fā)生不期望且不可逆變化，如細(xì)胞膜破壞和解凍后持水能力下降等[1]。而動(dòng)植物活體在低溫條件下會(huì)產(chǎn)生特殊蛋白，被稱為抗凍蛋白、醣蛋白和冰結(jié)構(gòu)蛋白，具有抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的功能[2-9]。麥苗作為一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、廉價(jià)且資源豐富的植物，對(duì)其低溫脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生具有抑制重結(jié)晶的蛋白質(zhì)在國(guó)外已有較多公開(kāi)報(bào)道[1,10-14]，如冬麥苗經(jīng)低溫脅迫后產(chǎn)生能顯著抑制果糖溶液重結(jié)晶。但由于麥種和生長(zhǎng)環(huán)境的不同，低溫脅迫下麥苗的性質(zhì)變化差異性很大。本研究擬以淮麥19為麥種，對(duì)發(fā)芽后的麥苗低溫脅迫，并用其制備小麥苗冰淇淋，考察了低溫脅迫對(duì)小麥苗汁（cold-acclimated wheat seedlings extract，AWSE）抑制熱休克冰淇淋重結(jié)晶能力的影響，為小麥苗的深度開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淮麥19 淮安市農(nóng)科院；奶油、綿白糖、玉米糖漿、單甘酯、脫脂奶粉 上海光明乳業(yè)股份有限公司；鏈霉蛋白酶E（活性4 000 U/g） 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

GTOP-158D光照培養(yǎng)箱 浙江托普儀器有限公司；DW-86L288超低溫冰箱 海爾公司；CX41顯微鏡（配綠色濾光片）、DP20成像系統(tǒng)（配DP2-BSW圖像分析軟件）奧林巴斯株式會(huì)社；HCS410顯微鏡冷熱臺(tái) 美國(guó)Instec公司； GL-20G-II高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 小麥苗低溫脅迫[15]

以淮麥19為實(shí)驗(yàn)材料，麥種經(jīng)10%（V/V）的次氯酸鈉溶液表面消毒10 min后，用滅菌蒸餾水清洗3 次，5 mmol/L的硝酸鈣溶液中浸泡3 h后置于光照培養(yǎng)箱中，采用營(yíng)養(yǎng)液培育，培養(yǎng)液由945 mg/L Ca(NO3)2·4H2O、506 mg/L KNO3、80 mg/L NH4NO3、136 mg/L KH2PO4、493 mg/L MgSO4、13.9 mg/L FeSO4·7H2O、18.65 mg/L Na2-EDTA、4.15 μg/L KI、31 μg/L H3BO3、111.5 μg/L MnSO4、0.125 μg/L CuSO4、43 μg/L ZnSO4、1.25 μg/L Na2MoO4、0.125 μg/L CoCl2和水組成[16]，使用前稀釋20 倍并調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值至6.9。小麥發(fā)芽條件為：每天白天25 ℃，LED人工光源光照12 h，強(qiáng)度為5 000 lx，夜間22 ℃、12 h，濕度控制在65%左右。待發(fā)芽1～2 cm后，改變光照強(qiáng)度至30 000 lx，其他條件不變。長(zhǎng)至一葉一心后，降低溫度分別至10、8、6、4 ℃進(jìn)行低溫脅迫處理不同時(shí)間（24、48、72、96 h），晝夜溫度一致，低溫脅迫后立即取葉片（長(zhǎng)度8～10 cm）。以未低溫脅迫處理麥苗作為對(duì)照（除4 ℃低溫脅迫后麥苗生長(zhǎng)明顯減緩?fù)?，其他脅迫溫度條件下長(zhǎng)勢(shì)無(wú)明顯變化）。

1.3.2 AWSE的制備

小麥苗清洗后，采用0.5%（V/V）的過(guò)氧乙酸浸泡5 min消毒，洗凈后浸入1 g/100 mL食鹽水，漂洗后投入0.2 g/100 mL的VC溶液中的比例30 min，再洗凈，按每100 g小麥苗加入15 g左右水的比例打漿，打漿過(guò)程中加入0.5 g/100 mL的VC，4 ℃、13 000 r/min冷凍離心2 次，各5 min，得澄清小麥苗汁、4 ℃冷藏備用。麥苗汁中可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)[17]。

1.3.3 小麥苗汁冰淇淋制作工藝

冰淇淋的基本配方如表1所示。

表1 冰淇淋基本配方Table 1 Ice cream formula

刺槐豆膠和5 倍質(zhì)量的綿白糖混勻，加水溶解。將剩余綿白糖和玉米糖漿攪拌溶解后加入奶粉，溶解后加熱至80 ℃，再加入刺槐豆膠穩(wěn)定劑溶液、單甘酯和奶油，保溫30 min后于高壓均質(zhì)機(jī)下80 ℃均質(zhì)15 min，一級(jí)均質(zhì)壓力18 MPa, 二級(jí)均質(zhì)壓力4 MPa。均質(zhì)后加入麥苗汁，冰淇淋漿料于4 ℃冰箱中老化4 h后，在冰淇淋機(jī)中－4～－2 ℃條件下冷凝14 min。－35 ℃硬化24 h以上[18]。

1.3.4 冰淇淋的熱休克處理和冰晶大小的檢測(cè)[14]

硬化后的冰淇淋放置于程序制冷器中，待冰淇淋升溫至－20 ℃后進(jìn)行熱休克處理，冰淇淋在程序制冷器中以1.67 ℃/h速度加熱升溫至－10 ℃，保溫42 h后，再以1.67 ℃/h速度冷卻至－20 ℃，保溫42 h，共計(jì)96 h，為一個(gè)周期，重復(fù)該周期共8 次。每周期始末采用帶有照相機(jī)的顯微鏡檢測(cè)冰晶塊大?。簩⒋郎y(cè)樣品移至－24 ℃制冷器中，用已預(yù)冷的刀片從中心部位取一小片冰淇淋鋪展于顯微鏡載玻片上，滴一滴已預(yù)冷至－24 ℃的異丁醇以遮蓋脂肪相，蓋上蓋片。將載玻片迅速移至－18 ℃ 的顯微鏡冷熱臺(tái)，對(duì)不同熱休克周期始末的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行拍照，由奧林巴斯DP2-BSW軟件分析圖像冰晶大小，采集至少3 個(gè)區(qū)域的300 個(gè)冰晶。采用logistic劑量反應(yīng)模型（SPSS 20.1）得到冰晶大小累積分布模型（以冰晶直徑計(jì)），冰晶大小均值X50按該模型達(dá)到50%累積分布的理論擬合冰晶直徑的中間值計(jì)。

冰晶大小增長(zhǎng)百分比（ice crystal growth power，IGP）是指熱休克處理周期末與周期始相比X50值增加百分比：

計(jì)算公式如下[18]：

AWSE抑制冰晶重結(jié)晶能力（ice crystal inhibition power，ICP）是指與添加參照物質(zhì)（水、NAWSE）相比，AWSE降低IGP的百分比，計(jì)算公式為[18]：

1.3.5 AWSE中可溶性蛋白對(duì)冰淇淋重結(jié)晶作用的影響

取6 ℃低溫脅迫48 h后小麥苗，按1.3.2節(jié)方法制備得到的AWSE 50 mL，加入2.5 mg鏈霉菌蛋白酶用以水解AWSE中的蛋白，以考察蛋白水解后AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶作用的影響。37 ℃保溫水解10 h后，4 ℃條件下，13 000 r/min離心10 min（兩次），得到酶處理后小麥苗汁（pronase E treated cold-acclimated wheat seedings extract，ETAWSE）[19]。按照1.3.3節(jié)的方法制作小麥苗汁冰淇淋，小麥苗汁添加量為10%（m/m），混合液總體積不變。與未添加AWSE、添加未低溫脅迫小麥苗提取液（non-cold-acclimated wheat seedlings extract，NAWSE）、ETAWSE所得冰淇淋比較，分析冰淇淋熱休克處理始末冰晶大小的變化。改變AWSE添加量分別為2.5%、5%、10%、15%、20%、25%，考察AWSE添加量對(duì)冰淇淋重結(jié)晶抑制作用的影響。

1.3.6 溫度脅迫下AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶的作用

按照1.3.1節(jié)的方法對(duì)小麥苗進(jìn)行低溫脅迫，脅迫溫度分別為10、8、6、4 ℃。低溫脅迫時(shí)間設(shè)定為24 h，其他同1.3.5節(jié)。

1.3.7 時(shí)間脅迫下AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶的作用

按照1.3.1節(jié)的方法對(duì)小麥苗進(jìn)行低溫脅迫，低溫脅迫時(shí)間分別為24、48、72、96 h。脅迫溫度設(shè)定為6 ℃，其他同1.3.5節(jié)。

1.3.8 熱休克處理頻率脅迫下AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶的作用

按照1.3.4節(jié)的方法進(jìn)行熱休克處理，頻率為－20 ℃和－10 ℃各24、48 h和96、192 h，其他條件不變，總時(shí)間保持32 d，其他同1.3.5節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)都重復(fù)3次，采用IBM SPSS 20和Origin Pro 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫處理對(duì)小麥苗汁蛋白質(zhì)含量的影響

表2 不同低溫脅迫處理溫度和時(shí)間后小麥苗汁中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度Table 2 Changes in soluble protein contents in AWSE after chilling stress at different temperatures for different durations

由表2可知，與未脅迫組相比，低溫脅迫處理后，AWSE中可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著上升（P＜0.05），且隨著溫度的下降和時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性蛋白質(zhì)含量上升明顯。原因可能是，低溫逆境條件下，蛋白質(zhì)作為植物細(xì)胞的保護(hù)物質(zhì)，可通過(guò)調(diào)節(jié)滲透濃度來(lái)啟動(dòng)脫落酸形成，從而誘發(fā)新的蛋白質(zhì)合成用以增加抗寒性，脅迫溫度越低和時(shí)間越長(zhǎng)，逆境條件越惡劣，從而誘導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)越多[12]。

2.2 低溫脅迫對(duì)AWSE抑制冰淇淋重結(jié)晶作用的影響

圖1 冰淇淋熱休克處理8 周期始末的均冰晶大小Fig.1 Comparison of mean ice crystal sizes of ice cream before and after 8 heat shock cycles

在食品混合體系中，冰晶生長(zhǎng)受大分子逆向擴(kuò)散和熱能釋放速率共同影響，加快逆向擴(kuò)散和熱移除，冰晶生長(zhǎng)隨之加快[20]。從圖1可以看出，熱休克處理開(kāi)始前，添加AWSE、NAWSE和ETAWSE冰淇淋的冰晶明顯小于未添加AWSE的冰淇淋（P＜0.05），原因可能是：由于未添加小麥苗汁，冰淇淋冷凍前水分含量高于其他樣品，導(dǎo)致冰淇淋冰相體積增加、黏度和離子強(qiáng)度降低，從而硬化時(shí)溫度轉(zhuǎn)換速率增加，熱移除速度較快，從而加速了冰晶增長(zhǎng)[21]。而其他3者中含有更多大分子，這些大分子需要先轉(zhuǎn)移到冰晶表面，然后定向分散并吸附到冰晶溶液交界面，這使得大分子的擴(kuò)散速度降低，從而降低了冰晶增長(zhǎng)速率。

冰淇淋經(jīng)8個(gè)周期的熱休克處理后，添加AWSE的冰淇淋冰晶明顯小于添加NAWSE組（P＜0.05），說(shuō)明冷脅迫產(chǎn)生的植物細(xì)胞保護(hù)物質(zhì)能顯著抑制冰淇淋的重結(jié)晶。AWSE冰淇淋冰晶也明顯小于ETAWSE組（P＜0.05），說(shuō)明抑制冰淇淋重結(jié)晶的物質(zhì)可能是AWSE中的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)可能為冰結(jié)構(gòu)蛋白（ice structuring protein，ISP）。關(guān)于AWSE中可能存在的ISP抑制冰晶生長(zhǎng)和重結(jié)晶的學(xué)說(shuō)中最廣為接受的是吸附抑制假說(shuō)[11,22-23]，即冰晶的弧度表面誘蛋白質(zhì)可吸附在冰晶-溶液交界面，從而抑制冰晶生長(zhǎng)，使熱休克過(guò)程中冰晶生長(zhǎng)點(diǎn)溫度低于熔點(diǎn)溫度而產(chǎn)生非依數(shù)性熱滯現(xiàn)象（達(dá)到相同濃度依數(shù)性熱滯效應(yīng)的300～500 倍）。熱休克處理始，加熱融化過(guò)程中出現(xiàn)重結(jié)晶和冰晶大小的增加，在高溫保溫過(guò)程中，冰晶大小的差異導(dǎo)致冰晶曲面半徑的差異，由于奧斯瓦爾德效應(yīng)，使得小冰晶逐漸消失并在大冰晶上重新析出[24]，而AWSE中可能存在的ISP可通過(guò)吸附抑制機(jī)理就可以阻止冰晶增長(zhǎng)，在重新冷卻過(guò)程中，AWSE中可能存在的ISP在降溫速率足夠低的條件下從溶液區(qū)轉(zhuǎn)移至到冰晶-溶液交界面，然后正確定向并擴(kuò)散于冰晶表面周圍，AWSE中可能存在的ISP蛋白結(jié)構(gòu)中的特殊結(jié)合部位通過(guò)冰晶彎結(jié)內(nèi)陷處嵌入冰格后被吸附，產(chǎn)生熱滯效應(yīng)而延緩冰晶重結(jié)晶[25]。AWSE中可能存在的ISP的特殊結(jié)合部分可與冰晶曲面結(jié)合后降低體系的自由能，因此使得水分子無(wú)法結(jié)合在冰晶上，冰晶增長(zhǎng)被抑制[25]。NAWSE中由于不存在或量遠(yuǎn)少于AWSE中可能存在的ISP，因此不能抑制重結(jié)晶，ETAWSE中可能由于蛋白酶的作用而導(dǎo)致可能存在的ISP結(jié)構(gòu)破壞，因此也不能抑制重結(jié)晶，這與NAWSE和ETAWSE冰淇淋的IGP無(wú)顯著差別（表3，P＞0.05）的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)驗(yàn)未對(duì)AWSE中可能存在的ISP進(jìn)行提取、分離和鑒定，也未測(cè)定其熱滯活性從而進(jìn)一步印證AWSE中ISP的存在，這將是本實(shí)驗(yàn)的下一階段研究?jī)?nèi)容。

表3 冰淇淋熱休克處理始末IGP和ICP實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of IGP and IRI before and after heat-shock treatment %

圖2 不同AWSE添加量對(duì)冰淇淋重結(jié)晶抑制作用的影響Fig.2 In fluence of AWSE concentration on its IRI activity on ice cream

增加NAWSE添加量，冰淇淋IGP沒(méi)有顯著變化（圖2，P＞0.05），說(shuō)明NAWSE無(wú)抑制冰晶重結(jié)晶作用。這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[14]。AWSE添加量與冰晶重結(jié)晶受到抑制作用相關(guān)。當(dāng)冰淇淋中麥苗汁體積分?jǐn)?shù)由2.5%增加至10%，AWSE對(duì)冰晶的抑制作用顯著增加（P＜0.05），IGP值由195.51%降至124.42%，AWSE的ICP由35.60%增至60.30%。繼續(xù)增加AWSE，對(duì)冰晶增長(zhǎng)的抑制作用不明顯，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[18]。AWSE中可能存在的ISP抑制冰晶增長(zhǎng)存在飽和值的原因可能包括兩方面，一是冰淇淋冰晶本身的表面積有限，二是不同來(lái)源的ISP由于結(jié)構(gòu)差別和抑制機(jī)理的不同，與ISP分子的結(jié)合部分能結(jié)合的冰晶位置和表面積也有限。ISP可能不能達(dá)到100%覆蓋率。因此，10%的AWSE對(duì)應(yīng)可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.462%（包含普通蛋白質(zhì)和可能存在的ISP）為抑制冰淇淋重結(jié)晶的飽和值。

2.3 脅迫時(shí)間對(duì)AWSE抑制冰淇淋重結(jié)晶作用的影響

6 ℃條件下改變低溫脅迫時(shí)間，AWSE抑制冰晶重結(jié)晶作用隨之變化（圖3）。冷脅迫48 h后冰淇淋的IGP降至最低，AWSE的ICP則相應(yīng)達(dá)到峰值。繼續(xù)增加脅迫時(shí)間對(duì)冰晶的重結(jié)晶的抑制作用不顯著（P＞0.05）。原因可能是，隨著低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，AWSE中可能存在的ISP含量增加，冰晶抑制作用也隨之提高，當(dāng)脅迫時(shí)間延長(zhǎng)至48 h后，AWSE中可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.462%，為AWSE抑制冰晶增長(zhǎng)的飽和值，因此繼續(xù)增加脅迫時(shí)間即使能增加AWSE中的蛋白質(zhì)含量，但對(duì)冰晶增長(zhǎng)的抑制作用已不顯著，這與前面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖3 冷脅迫時(shí)間變化對(duì)AWSE抑制冰淇淋重結(jié)晶作用的影響Fig.3 In fluence of cold acclimation duration on IRI activity of AWSE on ice cream

2.4 熱休克處理頻率對(duì)AWSE抑制冰淇淋重結(jié)晶作用的影響

圖4 熱休克處理頻率變化對(duì)AWSE抑制冰淇淋重結(jié)晶作用的影響Fig.4 In fluence of heat-shock frequency on IRI activity of AWSE on ice cream

改變熱休克頻率對(duì)AWSE抑制冰晶重結(jié)晶作用影響顯著（圖4，P＜0.05）。隨著熱休克頻率的下降，AWSE的作用顯著上升。原因可能是，熱休克頻率高時(shí)，在冷卻過(guò)程中，AWSE中的可能存在的ISP被快速冷卻的冰晶困住而吞沒(méi)，部分可能存在的ISP沒(méi)有足夠的時(shí)間由溶液區(qū)向冰晶-溶液界面遷移，因此冰晶增長(zhǎng)抑制作用降低，隨著熱休克頻率的下降，可能存在的ISP向溶液界面遷移增多，因此抑制重結(jié)晶能力上升。需要注意的是，添加NAWSE參照冰淇淋中的冰晶大小也有相同的變化趨勢(shì)，這說(shuō)明無(wú)論是否添加AWSE，重復(fù)溶解和冷凍會(huì)導(dǎo)致冰晶加速增長(zhǎng)，從而影響冰淇淋的感官特性。

圖5 熱休克處理每周期AWSE抑制冰晶重結(jié)晶能力的變化Fig.5 Variations in IRI activity of AWSE during each cycle of heat shock

AWSE在熱休克處理過(guò)程中抑制冰晶重結(jié)晶的能力隨著周期數(shù)的增加而減少（圖5），冰晶重結(jié)晶被抑制主要在熱休克的第1周期過(guò)程中。第3周期后，X50、IGP和ICP趨于穩(wěn)定。原因可能是：隨著周期數(shù)的延長(zhǎng)，熱休克開(kāi)始時(shí)冰晶增大，因此奧斯瓦爾德效應(yīng)降低，AWSE中可能存在的ISP作用逐漸下降，冰晶大小趨于均勻和穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶有顯著的抑制作用，NAWSE和ETAWSE則沒(méi)有，AWSE中起抑制重結(jié)晶作用的是冷脅迫過(guò)程中產(chǎn)生的可溶性蛋白質(zhì)；AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶的抑制作用存在峰值。通過(guò)降低脅迫溫度和延長(zhǎng)脅迫時(shí)間可顯著增加AWSE中可溶性蛋白質(zhì)含量；AWSE對(duì)冰淇淋重結(jié)晶的抑制作用隨熱休克單周期時(shí)長(zhǎng)增加而顯著增加，隨著周期數(shù)的延長(zhǎng)而顯著下降。

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