曲孟，李秀辰，白曉磊，楊福利，孫彩玲

(大連海洋大學(xué) 遼寧省漁業(yè)裝備工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023)

近年來(lái)，微藻作為一種重要的食品、化工和可再生能源的原料，備受人們關(guān)注［1-4］。但迄今為止，微藻的濃縮采收一直未能實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，其原因是微藻細(xì)胞小、濃度低，采收成本過高［5-6］。目前，生產(chǎn)過程中常用的采收方法有離心分離法、過濾法、泡載分離法、絮凝沉淀法和氣浮分離法等［7-8］，其中絮凝沉淀法具有操作簡(jiǎn)單、設(shè)備投資少等優(yōu)點(diǎn)，常與其他方法一起配合使用［9-10］，但絮凝劑的選擇很關(guān)鍵。張亞杰等［11］開展了聚合氯化鋁(PAC)、聚合硅酸硫酸鋁(PASS)和聚二甲基二烯丙基氯化銨(PDADMA)絮凝小球藻的研究，并對(duì)其實(shí)際應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，得出最低濃縮成本約為589 元/t;Divakaran等［12］研究發(fā)現(xiàn)，殼聚糖對(duì)于小球藻具有較好的絮凝效果;張國(guó)權(quán)等［13］利用殼聚糖絮凝小球藻，降低了現(xiàn)行的采收成本，為生產(chǎn)食用級(jí)的微藻產(chǎn)品提供了依據(jù);岳偉萍等［14］利用氫氧化鈉對(duì)海鏈藻Thalassiosira nordenskioldi 進(jìn)行絮凝試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)氫氧化鈉的質(zhì)量濃度為0.05 g/L 時(shí)，細(xì)胞的采收率可達(dá)85%;呂樂等［15］發(fā)現(xiàn)，納米鐵具有高效沉降藍(lán)藻的效果，當(dāng)pH 為5 時(shí)，10 min 內(nèi)可以絮凝沉降89.6%以上的水華藍(lán)藻Cyan bacteria 細(xì)胞。

氫氧化鈣是一種廉價(jià)易得的絮凝劑，電離產(chǎn)生游離Ca2+及各種帶正電荷的水解產(chǎn)物，小球藻表面的多羥基有機(jī)酸或糖類發(fā)生離解，從而使藻細(xì)胞表面帶有一定量的負(fù)電荷，兩者通過吸附或者電中和聚團(tuán)沉降［16-18］，而加入的氫氧化鈣可以在培養(yǎng)微藻過程中用CO2去除，因此，氫氧化鈣絮凝微藻具有一定的優(yōu)勢(shì)。但由于氫氧化鈣的水溶性較低，且容易受藻液體系的pH、鹽度等因素的影響，過多的添加量不僅達(dá)不到微藻采收的要求，且容易造成水體污染和成本浪費(fèi)。薛蓉等［19］對(duì)比了硫酸鐵、硫酸鋁、三氯化鐵和氫氧化鈣對(duì)小球藻的絮凝效果，發(fā)現(xiàn)用氫氧化鈣作為絮凝劑，成本最低，且上層清液可以繼續(xù)用于培養(yǎng)小球藻，但是并未對(duì)絮凝條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究中，選用氫氧化鈣作為絮凝劑，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法［20］對(duì)小球藻的絮凝條件進(jìn)行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

小球藻Chlorella vulgaris 購(gòu)自大連匯新鈦設(shè)備開發(fā)有限公司，氫氧化鈣(分析純)購(gòu)自天津博迪化工股份有限公司。

試驗(yàn)用儀器主要有 BSA124S 型電子天平、UV-7504 紫外可見分光光度計(jì)、雷磁pH-2F型pH 計(jì)、CX41 型生物顯微鏡。

1.2 方法

試驗(yàn)用小球藻原藻液的pH 為8.24，細(xì)胞密度為8.03×107個(gè)/mL，在680 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值(OD680nm)為0.921。

1.2.1 測(cè)定方法

(1)小球藻的細(xì)胞濃度。測(cè)定藻液在680 nm波長(zhǎng)下吸光度值，用以間接表示小球藻生物量的變化，記為OD680nm［21］。

(2)小球藻的采收率。取100 mL 藻液，加入不同量的氫氧化鈣，利用磁力攪拌器攪拌3 min，待均勻后靜置，用注射器緩慢抽取液面下4 cm 處的藻液，測(cè)定OD680nm，根據(jù)下式計(jì)算微藻的采收率:

其中:OD0為初始時(shí)刻藻液的OD680nm;ODt為絮凝時(shí)間t 時(shí)藻液的OD680nm。

1.2.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1)絮凝時(shí)間對(duì)采收率的影響試驗(yàn)。取100 mL 藻液，按0.1、0.3、0.8、1.6 g/L 加入氫氧化鈣，利用HJ-3 型恒溫磁力攪拌器攪拌3 min 后絮凝，每隔20 min 用注射器分別緩慢抽取各組液面下4 cm 處的藻液，測(cè)定OD680nm，每次取3 個(gè)平行樣求平均值，并計(jì)算采收率。

(2)絮凝劑添加量對(duì)采收率的影響試驗(yàn)。取100 mL 藻液，按0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、1.8、2.0 g/L 加入氫氧化鈣，固定絮凝時(shí)間，測(cè)定OD680nm，每次取3 個(gè)平行樣求平均值，并計(jì)算采收率。

(3)藻液濃度對(duì)采收率的影響試驗(yàn)。取100 mL 原藻液，用蒸餾水分別稀釋為原來(lái)的2、4、6、8、10 倍，固定絮凝時(shí)間和氫氧化鈣添加量，測(cè)定OD680nm，每次取3 個(gè)平行樣求平均值，并計(jì)算采收率。

(4)藻液pH 對(duì)采收率的影響試驗(yàn)。利用1 mol/L 鹽酸和1 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)藻液pH 為8 ～12，加入固定量的氫氧化鈣，絮凝一定時(shí)間，觀察不同藻液pH 對(duì)絮凝效果的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取對(duì)小球藻采收率影響顯著的因素，以3次平行試驗(yàn)所得的小球藻采收率的平均值作為響應(yīng)值(Y)，通過Design Expert 8.0.5 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，在此基礎(chǔ)上得出各因素之間的最佳組合。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 絮凝時(shí)間對(duì)絮凝效果的影響 從圖1可見:絮凝劑添加量為0.3、0.8、1.6 g/L 時(shí)，小球藻的采收率隨絮凝時(shí)間的增加而增大，前60 min 增加趨勢(shì)明顯，60 min 時(shí)采收率分別達(dá)到29.8%、80.5%和85.3%，之后，絮凝趨于穩(wěn)定;當(dāng)絮凝劑添加量為0.1 g/L 時(shí)，絮凝效果不明顯，采收率小于3.5%。絮凝時(shí)間相同時(shí)，采收率隨著絮凝劑添加量的增加而增大，絮凝時(shí)間為80 min 時(shí)，4 個(gè)絮凝劑添加量下小球藻的采收率分別為3.2%、30.3%、84.3%、89.4%。一般來(lái)說，絮凝時(shí)間越長(zhǎng)，絮凝劑與藻細(xì)胞之間、藻細(xì)胞相互之間接觸越充分，結(jié)團(tuán)沉降就越完全，采收率也越高。薛蓉等［19］研究發(fā)現(xiàn)，利用氫氧化鈣絮凝小球藻90 min時(shí)，采收率在90%左右，但是如果絮凝時(shí)間過長(zhǎng)，生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，細(xì)胞的活性也可能會(huì)發(fā)生改變。因此，考慮生產(chǎn)周期成本以及藻體的質(zhì)量，在本試驗(yàn)條件下，絮凝時(shí)間為60 ～80 min 時(shí)，絮凝效果較好。

2.1.2 絮凝劑添加量對(duì)絮凝效果的影響 從圖1可見:隨著絮凝劑添加量的增加，小球藻采收率隨之增高;當(dāng)絮凝劑添加量為0.6 g/L 時(shí)，小球藻絮凝效果驟增，采收率達(dá)到80.7%;絮凝劑添加量再增加時(shí)，采收率增加緩慢，當(dāng)絮凝劑添加量從0.6 g/L 增加到1.4 g/L，采收率僅從80.7%增加到92.2%。這是由于絮凝劑添加量增加，藻體與絮凝劑之間的碰撞幾率增大，絮凝效果顯著，特別是當(dāng)絮凝劑添加量增加到使藻液體系正負(fù)電荷中和的時(shí)候，絮凝效果最好，可獲得較高的采收率。繼續(xù)增加絮凝劑添加量，其對(duì)絮凝效果的影響減弱。因此，考慮到成本問題及后續(xù)生產(chǎn)的要求，在本試驗(yàn)條件下，絮凝劑添加量為0.6 ～0.8 g/L 時(shí)，絮凝效果較好。

2.1.3 小球藻濃度對(duì)采收率的影響 從圖1可見:隨著藻液濃度的降低，采收率隨之降低;當(dāng)稀釋倍數(shù)為8 倍時(shí)，采收率達(dá)84.5%，但當(dāng)稀釋倍數(shù)從8倍增加到10 倍時(shí)，采收率從84.5% 急劇降到58.9%?？梢姡瑢?duì)于低濃度藻液，絮凝劑與藻細(xì)胞、藻細(xì)胞之間碰撞結(jié)團(tuán)的幾率相對(duì)減少，采收率隨之降低。繼續(xù)稀釋時(shí)，體系中藻細(xì)胞數(shù)量較少，所帶的負(fù)電荷不足以中和絮凝劑電離產(chǎn)生的陽(yáng)離子所帶的正電荷，從而產(chǎn)生一定的排斥作用，致使采收率下降較明顯。因此，在本試驗(yàn)條件下，稀釋倍數(shù)為2 ～8 倍時(shí)，絮凝效果較好。

圖1 絮凝時(shí)間、絮凝劑添加量、小球藻濃度對(duì)采收率的影響Fig.1 Effects of flocculation time，flocculant dosage，and Chlorella vulgaris concentration on recovery ratio

2.1.4 藻液pH 對(duì)絮凝效果的影響 從表1可見:隨著藻液pH 的增加，小球藻采收率下降，當(dāng)藻液pH 由8 升至10 時(shí)，采收率由95.7%降至85.3%。這是由于隨著pH 的增加，氫氧化鈣的溶解性降低，電離產(chǎn)生的陽(yáng)離子數(shù)量減少的緣故。倘若降低藻液pH，雖然有利于小球藻的采收，但對(duì)于其細(xì)胞的正常生長(zhǎng)可能會(huì)產(chǎn)生影響，既不利于小球藻的循環(huán)培養(yǎng)，又會(huì)造成水體污染，從而增加了處理成本。當(dāng)藻液pH 為11 ～12 時(shí)，產(chǎn)生的絮凝物過于分散，達(dá)不到采收要求，且沉淀的小球藻顏色部分發(fā)白，這可能是由于過高的堿性使得藻細(xì)胞大量失水而失去活性。因此，在本試驗(yàn)條件下，小球藻藻液的pH 為8 ～10 時(shí)，絮凝效果較好。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化絮凝條件

絮凝時(shí)間、絮凝劑添加量和藻液pH 試驗(yàn)3 個(gè)因素的水平見表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表Tab.2 Factors and levels in a response surface analysis(RSA)test

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Design and results of RSA test

運(yùn)用Design Expert 8.0.5 軟件對(duì)采收率試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸模型為

對(duì)模型(2)中各因素進(jìn)行方差分析。從表4可見:絮凝時(shí)間、絮凝劑添加量和藻液pH 對(duì)采收率均有極顯著性影響(P＜0.01)，其中絮凝劑添加量的影響最顯著，其次是絮凝時(shí)間和藻液pH;絮凝時(shí)間與藻液pH 的交互作用以及絮凝劑添加量與藻液pH 的交互作用對(duì)采收率均有極顯著性影響(P＜0.01)，且前者要大于后者，而絮凝時(shí)間與絮凝劑添加量的交互作用對(duì)采收率的影響不顯著(P＞0.05);回歸方程也具有極顯著性(P＜0.01)，即絮凝時(shí)間、絮凝劑添加量和藻液pH 對(duì)采收率影響均極顯著。

表4 采收率回歸方程的方差分析Tab.4 ANOVA analysis of recovery ratio regression

響應(yīng)曲面和等高線如圖2 ～圖4所示。從圖2可見，曲面中的最高點(diǎn)在絮凝時(shí)間和絮凝劑添加量均達(dá)到最大時(shí)得到，和單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，說明絮凝時(shí)間和絮凝劑添加量的交互作用對(duì)采收率的影響較低。從圖2 ～圖4可見:絮凝時(shí)間與藻液pH的交互作用對(duì)采收率的影響最顯著;絮凝劑添加量對(duì)采收率的顯著性影響要高于絮凝時(shí)間，絮凝時(shí)間和絮凝劑添加量對(duì)采收率的顯著性影響均高于藻液pH，3 個(gè)因素對(duì)采收率的顯著性影響依次為絮凝劑添加量＞絮凝時(shí)間＞藻液pH。響應(yīng)面法分析結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

圖2 Y=f(A，B)的響應(yīng)面Fig.2 Responsive surface plot Y=f(A，B)

圖3 Y=f(A，C)的響應(yīng)面Fig.3 Responsive surface plot Y=f(A，C)

圖4 Y=f(B，C)的響應(yīng)面Fig.4 Responsive surface plot Y=f(B，C)

綜上所述，利用氫氧化鈣絮凝采收小球藻時(shí)，3 個(gè)因素中絮凝劑添加量對(duì)小球藻采收率的影響最顯著，因此，首先要控制絮凝劑的添加量;同時(shí)，考慮到3 個(gè)交互作用中絮凝時(shí)間與藻液pH 的交互作用對(duì)采收率的影響最顯著，合理控制絮凝時(shí)間與藻液pH 的交互作用，均可提高小球藻的采收率。

3 結(jié)論

(1)單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)絮凝時(shí)間為60 ～80 min、氫氧化鈣添加量為0.6 ～0.8 g/L和藻液的pH 為8 ～10 時(shí)，最有利于小球藻的采收。

(2)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，各因素對(duì)小球藻采收率均有極顯著性影響，依次為絮凝劑添加量＞絮凝時(shí)間＞藻液pH，絮凝時(shí)間與藻液pH 以及絮凝劑添加量與藻液pH 的交互作用對(duì)小球藻采收率均有極顯著性影響。絮凝時(shí)間、絮凝劑添加量和藻液pH 對(duì)小球藻采收率的影響可用二次回歸模型來(lái)描述。通過響應(yīng)面法優(yōu)化得出，當(dāng)絮凝時(shí)間為77 min、絮凝劑添加量為0.7 g/L和藻液pH 為9.3 時(shí)，小球藻采收效果最好，采收率為93.9%。

［1］孫靈毅，王力勇，趙強(qiáng).3種微藻兼養(yǎng)培養(yǎng)及營(yíng)養(yǎng)成分的比較［J］.大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19(2):146-149.

［2］陸德祥，呂鋒，張耀群，等.利用微藻生產(chǎn)生物柴油［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010(6):560-562.

［3］段敏.小球藻油制備生物柴油的試驗(yàn)和工藝優(yōu)化研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2011.

［4］李秀辰，牟晨曉，母剛，等.海洋微藻的加壓氣浮采收工藝研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(4):355-359.

［5］Molina Grima E，Belarbi E H，Acién Fernán-dez F G，et al.Recovery of microalgal biomass and metabolites:process options and economics［J］.Biotechnology Advances，2003，20(7):491-515.

［6］Uduman N，Qi Y，Danquah M.Dewatering of microalgal cultures:a major bottleneck to algae based fuels［J］.Renewable and Sustainable Energy，2010(2):1-15.

［7］高莉麗.微藻的溶氣氣浮采收技術(shù)研究［D］.青島:中國(guó)海洋大學(xué)，2010.

［8］Knuckey R M，Brown M R，Robert R，et al.Production of microalgal concentrates by flocculation and their assessment as aquaculture feeds［J］.Aquacultural Engineering，2006，35(3):300-313.

［9］張鵬，李興銳，張永奎.用殼聚糖絮凝法采收小球藻及上清液再利用的研究［J］.大連海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，27(2):162-165.

［10］Brennan L，Owende P.Biofuels from microalgae-A review of technologies for production，prcessing，and extractions of biofuels and co-products［J］.Renewable and Sustainable Energy Reviews，2010，14(2):557-577.

［11］張亞杰，羅生軍，蔣禮玲，等.陽(yáng)離子絮凝劑對(duì)小球藻濃縮收集效果的研究［J］.可再生能源，2010(3):35-38.

［12］Divakaran R，Pillai V N S.Flocculation of algae using chitosan［J］.Journal of Applied Phycology，2002，14(5):419-422.

［13］張國(guó)權(quán)，李琳.小球藻的絮凝沉降采收［J］.糧油加工與食品機(jī)械，2002(12):51-53.

［14］岳偉萍，王洪斌.海鏈藻絮凝及凝后保存技術(shù)研究［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2012，31(8):467-472.

［15］呂樂，楊曉靜，關(guān)珊珊，等.殼聚糖-納米金屬絮凝劑絮凝沉降水華藍(lán)藻研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2010，4(3):521-525.

［16］常青.水處理絮凝學(xué)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2011:40-57.

［17］陳春生，楊明德，黨杰，等.堿法絮凝氣浮分離鹽藻的研究［J］.海洋開發(fā)，2003(3):42-46.

［18］林喆，匡亞莉，郭進(jìn)，等.微藻采收技術(shù)的進(jìn)展與展望［J］.過程工程學(xué)報(bào)，2009，9(6):1242-1248.

［19］薛蓉，陸向紅，盧美貞，等.絮凝法采收小球藻的研究［J］.可再生能源，2012，30(9):80-84.

［20］吳有煒.試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理［M］.蘇州:蘇州大學(xué)出版社，2002:115-154.

［21］呂旭陽(yáng)，張?chǎng)瑮铌?yáng)蔡，等.分光光度法測(cè)定小球藻數(shù)量的方法研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(23):11104-11105.