鄭經(jīng)紅, 陳仕勇, 陳智華, 李世丹, 鐘金城

(1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

川西北高原野生垂穗披堿草遺傳多樣性的ISSR分析

鄭經(jīng)紅1, 陳仕勇2, 陳智華2, 李世丹2, 鐘金城1

(1. 西南民族大學(xué)青藏高原研究院, 四川 成都 610041; 2. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041)

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對25份來自川西北高原的野生垂穗披堿草(Elymus nutansGriseb.)種質(zhì)進行遺傳多樣性研究. 研究結(jié)果如下: (1)篩選出10條ISSR引物對25份材料共擴增出120條清晰的條帶, 其中多態(tài)性條帶85條, 多態(tài)性條帶比率為70.8%; 每條引物擴增條帶數(shù)變化為9-17條, 平均每條引物總擴增的帶數(shù)為12條, 其中多態(tài)性的條帶數(shù)變幅為3-16條, 平均每條引物的多態(tài)性條帶數(shù)為8.5條. (2)供試的25份垂穗披堿草種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)變幅為0.703-0.974, 平均值為0.828, 供試材料間表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性. (3)基于遺傳相似系數(shù)對供試材料進行了聚類分析和主成分分析, 聚類分析結(jié)果可以將供試的野生垂穗披堿草種質(zhì)資源分明顯分成3類, 聚類分析結(jié)果與材料的地理來源間具有一定的相關(guān)性.

垂穗披堿草; 遺傳多樣性; ISSR; 種質(zhì)保護

垂穗披堿草(Elymus nutans Griseb.), 又名鉤頭草、彎穗草, 是禾本科小麥族披堿草屬的一種重要的多年生草本植物[1-2]. 野生垂穗披堿草資源主要分布于我國的華北、西北、西南包括青藏高原等區(qū)域. 垂穗披堿草具有較強的生態(tài)適應(yīng)性和抗逆特性如具有極強的抗旱性和耐寒性, 其生境也包括了溝谷、灘地、高山林緣帶、灌叢草甸及高山草甸等. 該草草質(zhì)柔軟、無剛毛、無刺毛、無異味, 飼用價值較高, 是一種優(yōu)良的禾本科飼草[3]. 同時它也是草原和草甸等群落的重要組成成分, 具有較好的生態(tài)價值. 目前它與披堿草屬的另外一種飼草老芒麥均是青藏高原等高寒牧區(qū)退化草地改良及人工草地建設(shè)中應(yīng)用最為廣泛的牧草種類, 具有非常重要的推廣應(yīng)用價值. 但是目前我國審定登記的垂穗披堿草品種僅有“甘南”、“康巴”、“阿壩“三個品種. 其中“甘南”、“康巴”兩個品種年代較久, 品種退化較嚴重, 它們已經(jīng)遠不能滿足生態(tài)建設(shè)及草地畜牧業(yè)發(fā)展的需要, 所以亟待加快垂穗披堿草種質(zhì)資源的收集、創(chuàng)新及綜合評價研究.

簡單序列重復(fù)區(qū)間擴增多態(tài)性(Inter-simple sequence repeat, ISSR)是一種基于PCR技術(shù)的高效的分子標(biāo)記[4].相應(yīng)的ISSR引物可直接在植物基因組中進行PCR擴增, 擴增產(chǎn)物可以用聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳檢測. ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以高效、快速及靈敏地檢測出基因組DNA的多態(tài)性, 無需預(yù)先知道基因組DNA中的序列信息即可檢測. 同時, PCR擴增出的譜帶豐富且具有良好的重復(fù)性, 操作過程簡便、成本較低, 也適合于大樣本的檢測. 目前, ISSR分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)在植物種群遺傳學(xué)、種質(zhì)資源遺傳評價、分類學(xué)與系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等方面得到了迅速而廣泛的應(yīng)用[5]. 目前已在小麥族中的披堿草屬、仲彬草屬等資源的遺傳多樣性評價、系統(tǒng)發(fā)育與演化等方面得到成功的應(yīng)用[6-7]. 目前, 對于野生垂穗披堿草種質(zhì)資源的遺傳評價方面的研究報道還較少, 特別是對來自川西北高原分布的野生垂穗披堿草資源遺傳多樣性的研究還較少. 本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對收集自川西北高原的野生垂穗披堿草種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析, 為川西高原野生垂穗披堿草種質(zhì)資源的收集、保護及育種開發(fā)等提供有益的參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗收集了來自青藏高原東緣地區(qū)四川甘孜和阿壩的25份野生垂穗披堿草資源, 材料的編號和具體來源情況如表1所示.

1.2 DNA提取

將垂穗披堿草的種子剝?nèi)ネ怙笤诒渲械蜏乇４嫣幚?4h, 然后置于光照培養(yǎng)箱中24℃條件下發(fā)芽, 待供試的種子發(fā)芽后將幼苗轉(zhuǎn)移到實驗的瓦盆中. 數(shù)周后待其開始分蘗且葉片較多時取其較嫩的葉片提取基因組DNA. 植物基因組總DNA的提取采用改良的CTAB法進行[8]. 最后提取的植物DNA采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳法和紫外分光光度計法及檢測其純度和濃度.

表1 供試材料表Table 1 the material used in the study

1.3 引物篩選

試驗選取四個經(jīng)電泳檢測質(zhì)量較高材等料：川的西D獐N牙A菜進多行糖I的SS提R取引及物含的量測篩定選. 經(jīng)PCR及電泳分析后, 選擇多態(tài)性較好、條帶清晰的引物用作后續(xù)ISSR的研究分析. 最后試驗挑選了其中的10條多態(tài)性好及條帶較清晰引物, 篩選出的引物情況如表2所示.

1.4 ISSR擴增和電泳

本試驗擴增程序和反應(yīng)體系參照Ma等[9]的試驗進行. 反應(yīng)體系總體積20μL, 其中含1×PCR buffer(10mol/L Tris-HCl, 50mmol/L KCl, 0.1% Triton X-100, 1.5mol/L MgCl2), 0.2mmol/L dNTPs, 5pmol引物, 30 ng模板DNA, 1U Taq DNA聚合酶(北京天根公司). PCR擴增在PTC-200 PCR儀上進行擴增, 擴增程序: 94 ℃ 5 min(預(yù)變性); 94 ℃30S(變性), 51.3 ℃ 45 S(退火), 72 ℃ 2min(延伸), 45個循環(huán); 最后72 ℃延伸10min; 4 ℃保存.

PCR擴增的產(chǎn)物在6%濃度的聚丙烯酰胺凝膠中(丙烯酰胺: 甲叉=19: 1, 7.5mol/L尿素, 1×TBE緩沖液)進行分離并采用銀染法進行條帶檢測[10]. 每個樣品上樣6μL, 以D2000 Marker(北京天根公司)為對照, 在DYCZ-20D電泳儀(北京六一)上采用80W恒定功率條件進行電泳. 首先預(yù)電泳30min, 然后加樣電泳1h, 電泳結(jié)束后再用0.1%的AgNO3進行銀染色, 并在Na2CO3弱堿顯影液中進行顯色, 電泳結(jié)果采用數(shù)碼相機照相保存及分析.

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

在ISSR電泳分析圖譜中, 選擇條帶清晰且重復(fù)性較好的進行分析, 同時將實驗擴增產(chǎn)物的每一個條帶均視為一個位點, 然后統(tǒng)計本研究中擴增的總位點數(shù)及多態(tài)性位點數(shù). 按照條帶的有、無分別進行賦值, 有帶的記為1, 無帶的則記為0. 本研究中供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS值則按照Nei-Li的方法進行計算. 其相關(guān)的計算公式為: GS=2Nij/(Ni+Nj), 其中Nij為供試物種材料i和j中共有的擴增位點的數(shù)目, Ni表示材料i中出現(xiàn)的擴增位點的數(shù)目, Nj代表材料j中出現(xiàn)的擴增位點的數(shù)目. 另外, 在分析軟件NTSYS 2.1中, 根據(jù)不同材料間的遺傳相似系數(shù)GS值采用不加權(quán)成對群算術(shù)平均法(UPGMA)進行聚類分析和主成分分析[11].

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR標(biāo)記多態(tài)性

本試驗篩選出了10條擴增條帶清晰、多態(tài)性較好的引物對25份野生垂穗披堿草種質(zhì)資源進行了ISSR電泳分析. 本試驗中10條引物共擴增出了120條清晰的條帶, 其中多態(tài)性條帶為85條, 多態(tài)性條帶比為70.8%. 每條引物擴增的條帶數(shù)變幅為9-17條, 平均擴增的條帶數(shù)為12條; 其中條帶引物擴增的多態(tài)性條帶數(shù)變幅為3-16條, 平均值為8.5條(如表2所示). 本試驗ISSR電泳擴增出的片段長度大小約在200-2000bp之間(如圖1所示). ISSR分子標(biāo)記在垂穗披堿草資源遺傳多樣性評價中表現(xiàn)出了較好的效果.

表2 10個ISSR引物序列及擴增結(jié)果Table 2 The sequences and amplification results of 10 primers in the study

圖1 引物UBC807對25份垂穗披堿草的擴增圖Fig.1 PCR amplification patterns of primer UBC807 in 25 Elymus nutans

2.2 遺傳相似系數(shù)及聚類分析

在NTSYS軟件中基于Dice遺傳相似系數(shù)(GS值)計算出25份野生垂穗披堿草種質(zhì)間的遺傳相似性系數(shù)變幅為0.703-0.974, 其中供試材料的平均GS值為0.828, 供試野生垂穗披堿草表現(xiàn)出了豐富的遺傳多樣性. 在本研究中供試材料Y2227(四川巴塘)與Y2110(四川爐霍)的供試材料之間的遺傳相似系數(shù)GS值最小為0.703, 這也表明了這兩份垂穗披堿草種質(zhì)間的遺傳距離較遠, 它們間的親緣關(guān)系也相對較遠; 同時地理來源均來自于四川康定的W622107和Y2081這兩份供試材料間的遺傳相似系數(shù)GS值最高為0.9744, 這也表明了這兩份供試垂穗披堿草種質(zhì)的遺傳距離最小, 供試材料間的親緣關(guān)系也相對較近.

基于不同供試材料間的Dice遺傳相似系數(shù)值, 采用UPGMA法對供試的垂穗披堿草材料進行了聚類分析(如圖2所示). 從聚類圖中可以看出25份供試的垂穗披堿草材料被明顯地分成3個大類, 聚類分析與其地理來源表現(xiàn)出了一定的相關(guān)性. 第一類主要包括四川阿壩(205221、205229)、稻城(205116、205089、205096)、德格(Y2120、Y2126、PI619569)、甘孜(Y2155)以及紅原(205097、PI619520)的11份材料; 該類材料主要分布在川西

北高原的邊緣地帶. 第二類主要包括四川康定(PI639862、W622107、Y2081)、理塘(205106、205143)、爐霍(PI619521、Y2110)、壤塘(205218)以及乾寧(Y2095、Y2097)的10份材料; 此類材料主要分布在川西北高原的中南部. 第三類包括了四川康定(Y2084)、德格(Y2122)、巴塘(Y2227)以及稻城(205120)的5份材料; 該類的材料的聚類從地理來源上看較混雜, 和地理來源的相關(guān)性不是很大. 這可能與材料間具有相似的小生境有關(guān), 材料間發(fā)生了趨同變異.

圖2 25份垂穗披堿草材料基于遺傳相似系數(shù)的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 25 Elymus nutans based on genetic similarity coefficients

2.3 主成分分析

在NTSYS軟件中基于Dice遺傳相似系數(shù)對供試垂穗披堿草材料進行主成分分析, 并根據(jù)前三個主成分進行繪圖(如圖3所示). 在主成分分析圖中, 供試材料間的關(guān)系較近者其在圖中的位置便較近, 相反其親緣關(guān)系較遠者其在圖中的位置也較遠. 供試的垂穗披堿草種質(zhì)材料中來自同一地區(qū)或者相近地理來源的材料基本能夠劃分在一起. 這也表明了在本研究中聚類分析的結(jié)果與主成分分析的結(jié)果基本保持一致. 另外, 本研究中的主成分分析圖也更加直觀地反映了供試的垂穗披堿草種質(zhì)材料間的親緣關(guān)系.

圖3 25份垂穗披堿草基于ISSR標(biāo)記的主成份分析Fig.3 The principal coordinate analysis of 25 Elymus nutans based on ISSR data

3 討論

3.1 川西北高原野生垂穗披堿草ISSR標(biāo)記的遺傳多樣性

ISSR分子標(biāo)記由于其快簡便、快速、穩(wěn)定性和重復(fù)性較好等特點廣泛地應(yīng)用于植物遺傳研究的各個方面. 在本研究中, 篩選出的10條效果較好的ISSR引物能夠在25份供試材料中擴增出120條清晰的條帶, 這其中包括了多態(tài)性條帶85條, 多態(tài)性條帶比率為70.8%, 其揭示了川西北高原野生垂穗披堿草資源具有豐富的遺傳多樣性.本研究中ISSR標(biāo)記的多態(tài)性與相關(guān)研究中的RAPD的多態(tài)性效果相當(dāng), 但是ISSR的穩(wěn)定性和重復(fù)性明顯好于RAPD技術(shù)[12]. 另外, 本研究中的10條ISSR引物能夠?qū)?5份材料分開, 為種質(zhì)資源的鑒定等研究提供了一定的參考. 所以, 本研究也表明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在垂穗披堿草種質(zhì)資源的遺傳評價、種質(zhì)鑒定等中應(yīng)用是行之有效的.

3.2 川西北高原野生垂穗披堿草的遺傳變異

目前, 不同的技術(shù)和方法均在不同程度上揭示了不同地區(qū)內(nèi)垂穗披堿草種質(zhì)資源的遺傳多樣性.如馬嘯等[13]采用酸性聚丙烯凝膠電泳分析了來自于青藏高原等地區(qū)的33份野生垂穗披堿草種質(zhì)的醇溶蛋白遺傳多樣性, 其研究結(jié)果揭示了供試的垂穗披堿草材料間具有豐富的醇溶蛋白遺傳多樣性. 張建波等[14]也同樣采用酸性聚丙烯凝膠電泳分析了川西北高原不同垂穗披堿草種質(zhì)的醇溶蛋白遺傳特性, 其結(jié)果也揭示了該地區(qū)內(nèi)垂穗披堿草種質(zhì)資源具有豐富的醇溶蛋白遺傳多樣性, 同時其聚類分析與供試材料的海拔間表現(xiàn)出了一定的相關(guān)性. 鄧竹佳等[12]采用RAPD技術(shù)也揭示了28份來自川西北的野生垂穗披堿草的遺傳變異和分化情況. 這些研究結(jié)果與本研究的結(jié)果基本一致, 均不同程度地揭示了野生垂穗披堿草資源的遺傳變異和分化, 為垂穗披堿草資源的進一步創(chuàng)新和利用提供了參考.

3.3 川西北高原野生垂穗披堿草種質(zhì)資源的保護

對野生植物資源進行遺傳多樣性等評價, 可以為相關(guān)物種資源的保護和利用提供重要的參考[15]. 目前的一些研究都表明了川西北高原野生垂穗披堿草具有豐富的遺傳特性, 但是隨著沙化、退化、鹽堿化等生態(tài)環(huán)境的不斷惡化, 其野生優(yōu)異基因資源等都不同程度的受到破壞和喪失, 所以非常有必要對其制定合理的保護和利用策略. 楊智永等[16]研究了川西北若爾蓋地區(qū)的垂穗披堿草種群分化及其性狀的遺傳規(guī)律, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在細胞學(xué)核型和生物學(xué)性狀上存在顯著的差異; 其種群分化成了不同的氣候生態(tài)型及生物生態(tài)型. 嚴學(xué)兵等[17]研究了來自青海、甘肅地區(qū)9個垂穗披堿草種群的遺傳變異及其地理分化因素, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)海拔是影響其遺傳結(jié)構(gòu)的主要因素. Chen等[15]也分析了來自我國西部包括青藏高原地區(qū)垂穗披堿草的遺傳和地理分化, 研究發(fā)現(xiàn)地理隔離及海報等生態(tài)因子對其遺傳變異和分化具有重要的作用. 本研究中ISSR分析結(jié)果也揭示了川西北高原野生垂穗披堿草資源在其相近的生態(tài)地理區(qū)域內(nèi)表現(xiàn)出了一定的遺傳相似性. 所以本研究也建議在川西北地區(qū)垂穗披堿草應(yīng)該按照不同的生態(tài)地理區(qū)域進行保護和利用. 另外, 關(guān)于經(jīng)緯度、海拔等因子在野生垂穗披堿草種質(zhì)資源遺傳變異中的作用和重要性仍待進一步的研究和綜合分析.

[1] 盧寶榮. 披堿草屬與大麥屬系統(tǒng)關(guān)系的研究[J]. 植物分類學(xué)報, 1997, 35:193-207.

[2] 周永紅, 鄭有良, 楊俊良等. 10種披堿草屬植物的RAPD分析及其系統(tǒng)學(xué)意義[J]. 植物分類學(xué)報, 1999, 37: 425- 432.

[3] 陳默君, 賈慎修. 中國飼用植物[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 119-120.

[4] ZIETKIEWICZ E, RAFALAKI A, LABUD D, et al. Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J]. Genomic, 1994, 20:176-183.

[5] 樸紅梅, 李萬良, 穆楠, 等. ISSR標(biāo)記的研究與應(yīng)用[J]. 吉林農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 32: 28-31.

[6] 李永祥, 李斯深, 李立會, 等. 披堿草屬12個物種遺傳多樣性的ISSR和SSR比較分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005, 38: 1522-1527.

[7] 張利, 周永紅, 丁春邦, 等. 應(yīng)用ISSR標(biāo)記研究仲彬草屬植物的遺傳變異[J]. 廣西植物, 2006, 36: 375-380.

[8] WELSH J, MCLENLAND M. Fingerprinting Genome Using PCR with Arbitrary Primers[J]. Nucl Acids Res, 1990,18: 7213-7218.

[9] MA X, ZHANG XQ, ZHOU YH, et al. Assessing genetic diversity of Elymus sibiricus (Poaceae:Triticeae) populations from Qinghai-Tibet Plateau by ISSR markers[J]. Biochem Syst Ecol, 2008, 36: 514-522.

[10] SUN GL, SALOMON B, BOTHMER VON R. Analysis of tetraploid Elymus species using wheat microsatellite makers and RAPD

makers[J]. Genome, 1997, 40:806-814.

[11] ROHLF J F. NTSYS-PC: Numerical taxonomy and multivariate analysis system(Version 2.0)[M]. New York: Exeter software, 1994.

[12] 鄧竹佳, 苗佳敏, 張新全, 等. 川西北高原野生垂穗披堿草RAPD變異研究[J]. 草業(yè)與畜牧, 2010, 181: 17-21.

[13] 馬嘯, 周永紅, 于海清, 等. 野生垂穗披堿草醇溶蛋白遺傳多樣性分析[J]遺傳, 2008, 28: 699-706.

[14] 張建波, 白史且, 張新全, 等. 川西北高原野生垂穗披堿草醇溶蛋白遺傳特性研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 10: 121-124.

[15] CHEN SY, MA X, ZHANG XQ, et al. Genetic variation and geographical divergence in Elymus nutans (Poaceae: Triticeae) from west China[J]. Biochem Syst Ecol, 2009, 37(6): 716-722.

[16] 楊智永, 卞志高, 盤朝邦, 等. 若爾蓋高原垂穗披堿草種群分化和性狀遺傳規(guī)律研究[J]. 四川草原, 1995, 2: 1-16.

[17] 嚴學(xué)兵, 郭玉霞, 周禾, 等. 青藏高原垂穗披堿草遺傳變異的地理因素分析[J]. 西北植物學(xué)報, 2007, 27: 328-333.

Assessment of genetic diversity of Elymus nutans in northwest plateau of Sichuan province using ISSR markers

ZHENG Jing-hong1, CHEN Shi-yong2, CHEN Zhi-hua2, LI Shi-dan2, ZHONG Jin-cheng1
(1. Institute of Qinghai-Tibet Plateau, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.;
2. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

The genetic diversity of 25 Elymus nutans wild accessions from northwest plateau of Sichuan province was investigated using 10 ISSR primers. A total of 120 were detected, of which a total of 85 bands were polymorphic. The amplified bands for each primer were ranged from 9 to 17, in an average of 12. Likewise, the polymorphic bands for each primer varied from 3-16 bands with a mean of 8.5 bands. The genetic similarity (GS) values based on ISSR data ranged from 0.703-0.974 with a mean of 0.828, indicating a rich genetic diversity. The cluster analysis (UPGMA) and principle component analysis (PCA) based on ISSR data showed that all 25 Elymus nutans could be divided into three groups, which showed some correlation with the geographical origins of E. nutans.

Elymus nutans;genetic diversity; ISSR; germplasm conservation

S811.5; S812

: A

: 1003-4271(2014)03-0330-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.03.02

2014-03-25

陳智華(1961-), 男, 漢族, 陜西咸陽人, 教授, 博士, 研究方向: 生物多樣性保護.