吳美麗，蔣文明，劉 朔，侯廣宇，莊青葉，王楷宬，李金平，于建敏，王素春，黃保續(xù)，陳繼明，單 虎

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

親和素作為合成肽疫苗載體的初步研究

吳美麗1，2，蔣文明2，劉 朔2，侯廣宇2，莊青葉2，王楷宬2，李金平2，于建敏2，王素春2，黃保續(xù)2，陳繼明2，單 虎1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266109；2. 中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

將人工合成帶有生物素標(biāo)記的禽流感病毒兩條多肽與親和素結(jié)合，形成親和素-生物素-合成肽連接物，然后免疫小鼠。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行抗體檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些連接物能夠誘導(dǎo)抗親和素抗體的產(chǎn)生，但不能誘導(dǎo)抗合成肽抗體的產(chǎn)生，檢測(cè)結(jié)果表明親和素不能借助其與生物素的特異性結(jié)合，成為合成肽疫苗的理想載體。

合成肽疫苗；親和素；生物素；載體；禽流感病毒

現(xiàn)在用于疫病預(yù)防的疫苗大多數(shù)是對(duì)病原體進(jìn)行滅活或者減毒而制備的。實(shí)際上，這些疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性免疫反應(yīng)通常僅局限于疫苗中少數(shù)氨基酸或多肽[1]。人工合成這些誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)的多肽，將它們與某些大分子（即載體）共價(jià)偶聯(lián)后，能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。這類疫苗被稱為合成肽疫苗。目前，口蹄疫合成肽疫苗已應(yīng)用于我國(guó)口蹄疫的防控[2]。

合成肽疫苗具有生產(chǎn)成本小、使用安全、副作用小等優(yōu)點(diǎn)[1]，但這類疫苗在載體選擇和偶聯(lián)等方面，仍然存在諸多困難和疑惑。目前，合成肽疫苗的載體都依靠化學(xué)共價(jià)偶聯(lián)，不僅操作上較為困難，也難以控制偶聯(lián)的質(zhì)量。親和素（Avidin，本文縮寫為AV）與合成肽上標(biāo)記的生物素（Biotin，本文縮寫為B）能特異性結(jié)合，且這種結(jié)合反應(yīng)結(jié)合力強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，質(zhì)量易于控制[3]。但是，親和素能否借助這種特異性結(jié)合，成為合成肽疫苗的載體，尚不明確。本研究人工合成帶有生物素標(biāo)記的禽流感病毒兩條保守的多肽，將這兩條多肽與親和素結(jié)合，形成親和素-生物素-合成肽連接物，然后分別免疫小鼠，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)抗體，檢驗(yàn)這些連接物是否能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)合成肽的抗體。

1 材料與方法

1.1 多肽合成

由上海生工生物工程公司合成禽流感病毒基因中兩個(gè)保守的多肽，各20mg。其序列分別為RIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRL QLRDNA和MSLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD。這兩條合成肽分別針對(duì)禽流感病毒HA和M基因上一段保守的區(qū)域；以前研究提示它們能夠作為B細(xì)胞表位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體[4-5]。它們?cè)贜端都加有生物素，C端用氨基封閉。這兩合成肽分別命名為B-HA和B-M。

1.2 合成肽與親和素的連接

取340μL 200 μg/mL合成肽B-HA，加入660 μL親和素（購(gòu)自上海生工生物工程公司，配成5 mg/mL），混勻，37 ℃水浴反應(yīng)45 min，制備成B-HA與親和素的連接物（命名為AV-B-HA）；同法制備合成肽B-M與親和素的連接物（命名為AV-BM）。

1.3 免疫抗原的制備

取14 μL的B-HA（5 mg/mL），加入986 μL磷酸鹽緩沖液（PBS），然后加入1 mL佐劑，乳化制備成B-HA免疫抗原，同法制備B-M免疫抗原；取660 μL 親和素（5 mg/mL），加入340 μL PBS混勻后，加入1mL佐劑，乳化制備成AV免疫抗原；取上述水浴反應(yīng)制備的AV-B-HA連接物1 mL，加入1 mL佐劑，乳化制備成AV-B-HA免疫抗原，且同法制備AV-B-M免疫抗原。上述抗原所用佐劑均為弗氏不完全佐劑（購(gòu)自Sigma-Aldrich），乳化時(shí)間均為4～5 h，達(dá)到完全乳化的效果。

1.4 小鼠免疫

10日齡清潔級(jí)雌性小鼠18只（購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司）隨機(jī)分成6組；每組3只。第1至第5組分別接種B-HA、AV-B-HA、AV、B-M、AV-B-M免疫抗原；每只小鼠接種0.3 mL；每只小鼠首次免疫后第25天，進(jìn)行再次免疫；每組再次免疫所用的抗原和劑量同首次免疫；第六組為空白對(duì)照，不接種任何抗原。

1.5 血清樣品的采集

每只小鼠在首次免疫后第20天和再次免疫后第30天，斷尾，用毛細(xì)管采血。每只鼠采血20μL，加到100 μL PBS中，37 ℃放置2 h，4 ℃放置過(guò)夜，1500 r/ min離心5 min，分離血清，保存在-- 20 ℃。

1.6 抗體檢測(cè)

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）板（購(gòu)自海門市盛邦實(shí)驗(yàn)器材公司）；鏈霉親和素（streptavidin，本文縮寫為SA，購(gòu)自上海生工生物工程公司，它也能與生物素強(qiáng)有力地結(jié)合，但與親和素在抗原性上有顯著差異）。用SA、AV、SA-B-HA、SA-B-M、AV-B-HA、AVB-M分別作為包被抗原，濃度均為10 μg/mL。在ELISA板中，每孔加入包被抗原100 μL，4℃包被12 h，再用5 %脫脂乳37 ℃封閉2 h，然后加入稀釋好的鼠血清，37℃反應(yīng)2 h，再加入加酶標(biāo)羊抗鼠抗體（購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司），37℃反應(yīng)1 h，再加入底物TMB（購(gòu)自Amresco）進(jìn)行反應(yīng)，然后用硫酸終止反應(yīng)，最后在OD450波長(zhǎng)下測(cè)定各孔OD450值。在加封閉液、鼠血清、酶標(biāo)羊抗鼠抗體、底物之前，均用含吐溫的PBS液進(jìn)行洗滌。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 首次免疫后抗體檢測(cè)結(jié)果

用含鏈霉親和素（SA）的抗原，包括SA、SA-B-HA、SA-B-M，包被ELISA板，檢測(cè)各種抗原免疫小鼠的血清，得到的OD值均很低（表1）。用AV-B-HA包被ELISA板，檢測(cè)AV-B-HA免疫的小鼠血清，用AV-B-M包被ELISA板，檢測(cè)AV-B-M免疫的小鼠血清，用AV包被ELISA板，檢測(cè)AV免疫的小鼠抗體，得到的OD450都較高（表1）。陰性對(duì)照小鼠的血清檢測(cè)的OD值均＜0.08（表中未列出）。

2.2 再次免疫后抗體檢測(cè)結(jié)果

再次免疫后抗體檢測(cè)結(jié)果，與首次免疫后抗體檢測(cè)結(jié)果，完全相似（表2）

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明：用合成肽B-HA和B-M免疫小鼠，不能誘導(dǎo)抗合成肽的抗體，這是因?yàn)樗鼈儧](méi)有與載體偶聯(lián)；用親和素（AV）免疫小鼠，能誘導(dǎo)抗AV的抗體，但不能誘導(dǎo)鏈霉親和素（SA）的抗體，說(shuō)明AV與SA雖然都能與生物素緊密結(jié)合，但是它們沒(méi)有共同的抗原位點(diǎn)。

表1 5種抗原首次免疫后ELISA檢測(cè)OD450值

表2 5種抗原再次免疫后ELISA檢測(cè)OD450值

結(jié)果還表明用AV-B-HA免疫，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗AV-B-HA的抗體，但是不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗SA-B-HA的抗體，而用AV-B-M免疫，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗AV-BM的抗體，但是不能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗SA-B-M的抗體。這說(shuō)明AV-B-HA或AV-B-M免疫能誘導(dǎo)針對(duì)AV的抗體，不能誘導(dǎo)針對(duì)合成肽B-HA或B-M的抗體。因此，本研究提示AV不能借助于它與生物素的特異性結(jié)合，成為合成肽疫苗的理想載體。

合成肽疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)合成肽的抗體通常需要以下步驟。首先，抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）捕獲這些合成肽與載體的連接物，然后將它們運(yùn)送到APC細(xì)胞內(nèi)的吞噬小體中，在吞噬小體中對(duì)合成肽與載體的連接物進(jìn)行切割，形成T細(xì)胞表位（T cell epitope，TCE），然后APC將TCE通過(guò)MHC-II分子，提呈給T輔助細(xì)胞，激活T輔助細(xì)胞。被激活的T細(xì)胞與特定的B細(xì)胞，即與合成肽-載體連接物中的載體那部分相結(jié)合的B細(xì)胞，相互作用，能激活這些B細(xì)胞產(chǎn)生抗載體的抗體；而被激活的T細(xì)胞與特定的B細(xì)胞，即與合成肽-載體連接物中的合成肽那部分相結(jié)合的B細(xì)胞，相互作用，才能激活這些B細(xì)胞產(chǎn)生抗合成肽的抗體[6]。

本研究提示親和素借助于它與生物素的特異性結(jié)合，形成親和素-生物素-合成肽的連接物，只能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)載體的抗體，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)合成肽的抗體。其原因可能是在疫苗乳化階段，或進(jìn)入機(jī)體內(nèi)部在T細(xì)胞和B細(xì)胞激活之前，在某種化學(xué)作用、物理作用或生物作用下，親和素與標(biāo)記生物素的合成肽的連接物被斷開，從而不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)抗合成肽的抗體；也有可能合成肽通過(guò)生物素與親和素連接后，其發(fā)生了空間構(gòu)象的變化，導(dǎo)致合成肽的抗原性發(fā)生改變。由于缺乏深入研究的數(shù)據(jù)，本研究發(fā)現(xiàn)的親和素借助于它與生物素的特異性結(jié)合，作為合成肽疫苗的載體，不能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)合成肽的抗體的具體原因，尚并不清楚。繼續(xù)深入開展這項(xiàng)研究，不僅有利于進(jìn)一步提高合成肽疫苗研究水平，也能夠以此為模型，研究體液免疫反應(yīng)或抗體產(chǎn)生的機(jī)制。

[1] WHO. Guidelines for the production and quality control of synthetic peptide vaccine[EB/OL]. （1999） [2013-9-15]. http：//www.who.int/biologicals/vaccines/synthetic_peptide_ vaccines/en/.

[2] Bittle J L，Hoμghter R A，Alexander H，et al. Protection against foot and mouth disease by immunization with a chemically synthesized peptide predicted from the viral nucleotide sequence [J]. Nature，1982，298：30-33.

[3] Vaknin D，Als-Nielsen J，Piepenstock M，et al. Recognition processes at a functionalized lipid surface observed with molecular resolution [ J ] . Biophysical journal，1991 ，60（6）：1545 - 1552.

[4] Michael S，Marina D F，Walter F，et al. Universal M2 ectodomain-based influenza A vaccines：preclinical and clinical developments [J]. Expert Rev Vaccines，2009，8（4）：499-508.

[5] Lee J S，Chowdhury M Y，Moon H J，et al. The highly conserved HA2 protein of the influenza a virus induces a cross protective immune response [J]. Journal of Virological Method，2013，194：280-288.

[6] 陳繼明，黃保續(xù). 重大動(dòng)物疫病流行病學(xué)調(diào)查指南[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版，2009：45-50.

Preliminary study of avidin as synthetic peptide vaccine carrier

Wu Meili1，2，Jiang Wenming2，Liu Shuo2，Hou Guangyu2，Zhuang Qingye2，
Wang Kaicheng2，Li Jinping2，Yu Jianmin2，Wang Suchun2，Huang Baoxu2，Chen Jiming2，Shan Hu1

（1. Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China；
2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032，China.）

In this study，two peptides labeled of avian infuenza virus with biotin were synthesized，and mixed with avidin to form avidin - biotin - peptide complexes，and used to immunize mice. Antibody was detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. The detection results showed that these complexes could induce anti-avidin antibodies，but they couldn’t induce antibodies against the synthesized peptide，suggesting that avidin cannot be considered as an ideal carrier of synthetic peptide vaccine through its specifc binding to biotin.

synthetic peptide vaccine；avidin；biotin；carrier；avian infuenza virus

S852.659.5；TQ563.7

：B

：1005-944X（2014）09-0077-03

陳繼明