林榮+劉燕飛+陳溫茹+文金生+王彬

摘要] 目的 了解溫州市無償獻血人群丙型肝炎病毒感染及其基因分型的情況。 方法 對2010年1月～2012年12月溫州中心血站采集的無償獻血者血液進行丙型病毒性肝炎病毒抗體（抗-HCV）的檢測，并對檢驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，同時采用RT巢式-PCR法，對2012年度68例HCV-IgG陽性者進行HCV-RNA的檢測及基因分型。結(jié)果 溫州市無償獻血者丙型肝炎病毒抗體不合格率各年份基本保持穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；而68例抗-HCV陽性標(biāo)本的基因分型結(jié)果顯示，2a單陽性為4.41%，1b單陽性為30.88%，1b和2a雙陽性為60.29%，1b總陽性率為91.18%，2a總陽性率為 64.71%。 結(jié)論 溫州市無償獻血者HCV感染率不高，總體趨穩(wěn)，所感染的HCV基因型以1b型占優(yōu)勢，并且基因型1b和2a混合感染率較高。

[關(guān)鍵詞] 獻血者；丙型肝炎病毒；感染率；聚合酶鏈反應(yīng)；基因分型

[中圖分類號] R512.6；R457.1 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）02-0151-03

Study on the infection of hepatitis C virus and its genotypes among voluntary blood donors in Wenzhou

LIN Rong1 LIU Yanfei1 CHEN Wenru1 WEN Jinsheng2 WANG Bin1

1.Wenzhou City Central Blood Center，Wenzhou 325001，China； 2.Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To analyze the infection of HCV and investigate the feature of HCV genotypes among voluntary blood donors in WenZhou. Methods The results of HCV-IgG by ELISA among voluntary blood donors in wenzhou from 2010 to 2012 were statistically analyzed and HCV genotyping was performed using RT- PCR. Results The unqualified rate for anti-HCV was not obviously different year by year（P<0.05）. Among 68 subjects， the percentage of genotype 2a single positive was 4.41%， the percentage of genotype 2b single positive was 30.88%， the percentage of genotype 2b and 2a double postive was 60.29%， the percentage of total 1b infection was 91.18%， the percentage of total 2a infection was 64.71%. Conclusion The unqualified rate of HCV is not obviously different every year. There are genotype 1b and 2a in Wenzhou， while 1b genotype is the majority， and the rate of 1b and 2a co-infection is high.

[Key words] Voluntary blood donor；Hepatitis C virus； Infection rate； Polymerase chain reaction； Genotype

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）是丙型肝炎的病原體，人感染丙肝病毒后比感染乙肝病毒更容易轉(zhuǎn)化成慢性肝炎，并可能發(fā)展成肝硬化和肝癌，而且病毒主要通過血液傳播，是導(dǎo)致輸血后肝炎的主要病原體，因此血站作為臨床用血提供部門做好血液的篩查就顯得十分重要。因為丙肝病毒基因組具有異源性和高度可變性，所以在長期演化過程中丙肝病毒可產(chǎn)生眾多的變異毒株（基因型） 和病毒基因型，具有在人群分布顯著差異的特點。目前尚無溫州地區(qū)無償獻血者丙肝感染基因型的報道。本研究采用ELISA方法對采集的血液標(biāo)本進行抗HCV檢測，通過分析得出獻血群體中HCV的感染情況，并且通過RT-巢式PCR技術(shù)進行HCV基因分型的研究，以探討溫州無償獻血群體HCV基因型的分布特征。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2010年1月～2012年12月溫州中心血站采集的所有無償獻血者的血液標(biāo)本。獻血者來自社會各界，符合《獻血者健康檢查要求》。并對2012年度的68例抗-HCV 陽性血清標(biāo)本進行HCV基因分型，抽取獻血袋待測管中血液5 mL，立即于-80℃保存，備用。

1.2 材料和試劑

HCV抗體診斷試劑盒購自上?？迫A生物技術(shù)公司；全血RNA提取試劑盒購自上海飛捷生物技術(shù)有限公司；RNA酶抑制劑、Taq酶、dNTP混合物、DEPC、引物、Marker等購自上海捷瑞生物工程有限公司；M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 HCV抗體的檢測 采用ELISA法，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行，結(jié)果由儀器自動判讀。endprint

1.3.2 RT-巢式PCR檢測HCV-RNA和基因分型 具體操作參照okamoto法[1]進行。主要步驟為：提取血清總RNA；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以HCVCore基因區(qū)分型PcR引物（引物序列見表1）行套式PCR擴增，兩輪PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同。反應(yīng)體系：10 倍稀釋的PCR 緩沖液3 μL，2.5 mmol/L，dNTP 2 μL，dH2O 20.6 μL，上、下游引物各1.5 μL，Taq 酶0.4 μL，模板DNA 1 μL，共計30 μL；反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 min，72℃延伸30 s，35 個循環(huán)，72℃延伸10 min。以聚丙烯酞胺凝膠電泳分析PCR終產(chǎn)物。

表1 HCV-RNA基因分型所用引物

2 結(jié)果

2.1 2010～2012年度溫州市無償獻血血液檢測抗-HCV 不合格率情況

2010～2012年度溫州市無償獻血者血液抗-HCV檢測不合格率見表2，丙肝病毒的感染情況總體趨穩(wěn)，各年份變化不大，但相比湖南岳陽市2006～2010年[2]、深圳市寶安區(qū)2004～2011年[3]報道的平均不合格率低。

表2 2010～2012年度溫州市無償獻血者血液抗-HCV檢測不合格率

注：*與2012年比較，**與2010年比較，#與2011年比較

2.2 RT-巢式PCR檢測HCV-RNA結(jié)果（圖1）

PCR產(chǎn)物長度為144 bp對應(yīng)基因型為1b，PCR產(chǎn)物長度為174 bp對應(yīng)基因型為2a，PCR產(chǎn)物長度為144 bp和174 bp則對應(yīng)基因型1b、2a。

圖1 HCV基因型分型結(jié)果，A為1b陽性（144bp），2a陰性，B為1b陰性，2a陽性（174bp），C為1b陽性（144bp），2a陽性（174bp）

2.3 HCV-RNA基因分型結(jié)果

在所檢測的68例標(biāo)本中基因型1b占30.88%，基因型2a占4.41%，基因型1b和2a占 60.29%，1b總陽性率為91.18%，2a總陽性率為64.71%，未檢出1a和2b基因型。

3 討論

丙型肝炎病毒是一種常見的肝炎病毒，主要是通過血液傳播導(dǎo)致機體感染，是最常見的引起輸血后肝炎的病原體[4-5]。因其傳播與血液有關(guān)，而且國內(nèi)外的采血站都有過丙型肝炎（HCV）爆發(fā)的報道[6-9]，所以血站是防控丙肝的重點區(qū)域，獻血人群是重要的監(jiān)控群體。目前人群中丙型肝炎病毒的感染狀況主要根據(jù)血清抗-HCV陽性的高低來衡量[10]。本研究表明溫州無償獻血群體抗-HCV檢測平均不合格率為0.223%，且逐年變化不大，但低于岳陽、深圳等國內(nèi)其它城市的報道[2，3]。由于血清抗-HCV陽性是造成血站血液報廢的原因之一，所以應(yīng)制定更為嚴(yán)格的獻血者血液檢驗標(biāo)準(zhǔn)，采用如PCR等更加可靠的方法，提高HCV感染的早期檢出率，以減少不必要血液報廢。

由于輸血傳播是引起丙肝的主要原因，故了解無償獻血者感染的丙肝病毒基因類型對于了解整個地區(qū)的病毒感染情況有重要的意義。丙肝病毒的基因分型通常按照Simmonds等[11]將HCV 基因分為1～6 型，不同基因型或基因亞型的丙肝患者，在臨床表現(xiàn)以及治療方面均有差異，在治療之前進行HCV 基因分型對判定治療難易程度及制定治療方案等非常有幫助[12-13]。已有研究表明在我國南方沿海城市丙肝病毒基因型主要以1b型為主，大概占90%以上；而在我國北方城市其基因型主要是2a型，大概占46%～70%[14]。而目前溫州地區(qū)無償獻血群體HCV基因型分布的情況還沒有相關(guān)的研究報道。因此，本研究以無償獻血群體為研究對象，通過RT-PCR的方法對無償獻血者抗-HCV陽性的血液標(biāo)本做了基因分型的檢測，結(jié)果表明無償獻血群體HCV感染者中1b基因型的比率高于2a基因型，而且1b和2a混合感染者的比率（60.29%）也極高，1b總陽性率高達91.18%，2a總陽性率為64.71%，但是未檢測到1a和2b基因型，與文金生等報道的比例相似[15]。無償獻血者所感染的HCV 基因型分布情況和輸血后丙型肝炎患者基因型分布情況非常相近，兩者之間差異無顯著性，提示獻血群體HCV 感染者是輸血后丙型肝炎的主要傳染源，這也進一步說明加強獻血者篩選、排除HCV 感染者在控制丙肝傳播中的重要性。

總之，本研究一定程度上反映了本地區(qū)獻血群體HCV感染及病毒基因分型情況。為了消除因病例少造成的影響，在今后的研究中，將繼續(xù)選取標(biāo)本來研究本地區(qū)HCV基因型分布特征。

[參考文獻]

[1] Okamoto H，Okada S，Kurai K. Detection of hepatitis C virus RNA by a two-stage polymerase chain reaction with two pairs of primers deduced from the 5-' noncoding region[J]. Jpn J Exp Med，1994，60：215-222.

[2] 孫昂，蘇湘暉. 岳陽市無償獻血者4 項傳染病指標(biāo)檢測結(jié)果分析[J]. 現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012，12（28）：1817-1820.

[3] 黃守民，張健，劉宜仲，等. 深圳市寶安區(qū)2004～2011年無償獻血者血液5項指標(biāo)檢驗結(jié)果分析[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2012，14（9）：1789-1790.

[4] 莊輝. 重視丙型肝炎的研究[J].中華肝臟病雜志，2004，12（2）：65.

[5] 池覃春. 新編實用肝病學(xué)[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 1992：168.

[6] 劉立，周吉坤，張勇，等. 河北趙縣獻血村丙肝感染情況調(diào)查[J]. 醫(yī)學(xué)動物防制，2010，2（11）：990-992.

[7] 王軍. 輸血傳播丙肝的危險度評估[J]. 國外醫(yī)學(xué)：輸血及血液學(xué)分冊，2001，24（2）：179.

[8] Laskus T1. Follow-up of NANB hepatitis outbreak in plasmaphersisunit[J].Lancet， 1989， 1：391.

[9] 趙進奎，李克偉，田鵬. 一起血液透析相關(guān)的丙肝感染暴發(fā)調(diào)查[J]. 中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2013，153（1）：95-96.

[10] Alberti iA， Benvegne L1. Management of hepatitis C[J]. JHepatol， 2003， 38（Supp1）： 104-l18.

[11] Simmonds P. Classification of hepatitis C virus into six major genotypes and a series of subtypes by phylogenetic analysis of the NS-5 region[J].Gen Virol，1993，74（11）：2391-2399.

[12] 謝晨，吳建瑩，王一強，等.丙型肝炎病毒基因分型及其意義的研究進展[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2001， 21（增刊）：148-149.

[13] 周君霞，梁寧. 丙型肝炎病毒不同分型方法的分析及分型意義[J]. 標(biāo)記免疫分析與臨床， 2007，14（3）：190-192.

[14] 蘇英豪. 丙型肝炎病毒基因分型及其意義：近幾年來的研究進展[J]. 國外醫(yī)學(xué)：微生物學(xué)分冊，1998，26（1）： 8211-8212.

[15] 文金生，段志良，陳俊，等. 溫州地區(qū)62例HCV感染者的基因型特征研究[J].臨床血液學(xué)雜志，2009，22（2）：70-72.

（收稿日期：2013-08-29）endprint