蘇文鳳，韋中亞，顧 蕓，沈筠恬，陳 罡

（南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇226001）

施萬細胞與背根節(jié)神經(jīng)元體外共培養(yǎng)成髓鞘模型的建立*

蘇文鳳**，韋中亞，顧 蕓，沈筠恬，陳 罡

（南通大學江蘇省神經(jīng)再生重點實驗室，江蘇226001）

目的：探討施萬細胞與背根節(jié)神經(jīng)元髓鞘化共培養(yǎng)的標準化方法,為研究周圍神經(jīng)髓鞘化的形成機制提供穩(wěn)定的周圍神經(jīng)髓鞘化體外模型。方法：取出生1～3 d新生SD大鼠，培養(yǎng)施萬細胞，經(jīng)純化鑒定后用于共培養(yǎng)。取孕14～15 d的SD大鼠胚鼠背根神經(jīng)節(jié)，經(jīng)純化后用于共培養(yǎng)；將2種分別純化的細胞進行共培養(yǎng)，加抗壞血酸誘導髓鞘的形成。利用免疫組化染色、掃描電鏡和透射電鏡，檢測髓鞘的形成。結果：純化后施萬細胞純度可達到98%以上，可用于共培養(yǎng)。背根節(jié)神經(jīng)元貼壁良好，經(jīng)純化后幾乎無雜細胞可見，可用于共培養(yǎng)。對共培養(yǎng)細胞進行MAG與NF的免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)有數(shù)量可觀的髓鞘形成，并且髓鞘是緊密包繞在神經(jīng)元軸突上。掃描電鏡下可觀察到施萬細胞包繞軸突形成髓鞘，而透射電鏡下則可觀察到有致密的髓鞘板層結構形成。結論：本實驗成功建立穩(wěn)定可靠的體外成髓鞘模型，可用于軸突的新髓鞘化實驗研究。

施萬細胞；背根節(jié)神經(jīng)元；髓鞘形成；免疫熒光染色法；大鼠

1 材料與方法

1.1 材料 （1）實驗動物：SPF級出生1～3d的SD大鼠培養(yǎng)施萬細胞，SPF級孕14～15d的SD大鼠培養(yǎng)背根節(jié)神經(jīng)元。大鼠（均由南通大學實驗動物中心提供，動物使用許可證：XYSK（蘇）2007-0021），實驗過程中對動物處置符合動物倫理學標準。（2）主要試劑：神經(jīng)生長因子（NGF)，5-氟尿嘧啶(5-FU)，尿嘧啶 (U)，0.25%胰酶，F(xiàn)orskolin，L-抗壞血酸，ITS supplement，Thy 1.1和β-阿糖胞苷均（Sigma公司）；HRG (Human neuregulin)β1（proteintech公司）；DMEM培養(yǎng)基，Neurobasal培養(yǎng)基(NB)，B27，胎牛血清（FBS，Gibco公司）；補體（Invitrogen公司）；兔抗MAG，鼠抗NF-200，鼠抗S100（Sigma公司）；羊抗兔IgG-Cy3，羊抗鼠IgG-Cy3和羊抗鼠IgG-Alex-488（Invitrogen公司）。

1.2 方法 （1）施萬細胞的培養(yǎng)與純化：出生1～3d的新生SD大鼠，經(jīng)冰凍、75%乙醇消毒后，無菌條件下取出坐骨神經(jīng)。剝膜后放入1mg/mL膠原酶和0.125%的胰酶消化30min，以1×106個/mL的密度接種于預先用PDL包被的培養(yǎng)皿中。放入37℃，5%的CO2培養(yǎng)箱中，24h后換成含β-阿糖胞苷(終濃度為10μmol/L)的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h后換成終濃度為2μmol/L Forskolin和10 ng/mL LHRGβ1的10% FBS DMEM培養(yǎng)基，每3d換液。3～5d待細胞生長至融合，消化收集細胞懸液，加成纖維細胞特異性抗體Thy 1.1(1∶1 000稀釋于10%FBS DMEM培養(yǎng)基)。冰上孵育2h，離心棄上清，加補體(1∶3稀釋于DMEM培養(yǎng)基)重懸，37℃孵育1h。DMEM培養(yǎng)基清冼2遍后，接種于預先PDL包被的培養(yǎng)皿中備用。（2）背根節(jié)神經(jīng)元的培養(yǎng)與純化：孕14～15d的SD大鼠，通風櫥內乙醚麻醉后備皮。75%的乙醇消毒后，無菌條件下取出胚鼠，解剖鏡下取出背根神經(jīng)節(jié)，將背根神經(jīng)節(jié)接種于PDL包被的24孔板中。24h后換含有U(10μmol/L)、5-FU(10μmol/L)、Glutamine(2mmol/L)和2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)2d。后換含有Glutamine(2 mmol/L)和2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)2d，重復前面步驟3次，即可得到較純的背根節(jié)神經(jīng)元。以上所使用的培養(yǎng)基均含有50ng/mL的NGF。（3）背根節(jié)神經(jīng)元與施萬細胞共培養(yǎng)：將純化后的施萬細胞培養(yǎng)1～2d，0.125%的胰酶消化，制備單細胞懸液后計數(shù)。細胞密度調至1×105個/mL，以500μL/孔的量與事先純化好的神經(jīng)元細胞共培養(yǎng)。1d后換成含有Glutamine(2 mmol/L)和2%B27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)2d。2d后換成含有2%ITS和2%BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4d(每2d換1次液)。然后換成含 50μg/mL抗壞血酸 15%FBS DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，直到髓鞘形成(每2d半量換液)。以上所使用的培養(yǎng)基均含有50ng/mL的NGF。（4）免疫熒光染色：施萬細胞純度鑒定，經(jīng)過純化后的施萬細胞，用0.01 mol/L PBS洗3遍后，4%多聚甲醛室溫下固定30min。0.01 mol/L PBS清冼3遍，加入適量封閉液室溫封閉1h，然后加入鼠抗S100(1∶400)一抗4℃孵育過夜。0.01 mol/L PBS清冼3遍，每次5min，避光加入羊抗鼠IgG-Cy3(1∶1 000)二抗室溫下避光孵育2h。棄掉二抗進行Hochest室溫染色15min，于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。MAG免疫熒光染色：施萬細胞與背根節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng)21d后，用0.01mol/L PBS洗3次，4%多聚甲醛室溫固定10min，棄掉4%多聚甲醛用預冷的甲醇-20℃固定6min。棄掉甲醇后用0.01M PBS洗3次，封閉液室溫封閉1h。然后用兔抗MAG(1∶200)一抗和鼠抗NF(1∶500)一抗4℃孵育過夜，0.01mol/L PBS洗3次。避光加入羊抗兔IgG-Cy3(1∶1 000)二抗和羊抗鼠IgG-488(1∶1 000)二抗，室溫孵育1h。用0.01 mol/L PBS洗3次后，于激光共聚焦顯微鏡下拍照觀察。（5）掃描電鏡：細胞經(jīng)處理后，固定于預冷的2.5%的戊二醛。鞣酸洗滌后固定于1%鋨酸，乙醇梯度脫水，叔丁醇置換2次，放入冷凍干燥機冷凍干燥后粘貼標本并噴金，掃描電鏡下觀察標本。（6）透射電鏡：細胞經(jīng)處理后，固定于預冷的2.5%的戊二醛，后再固定于1%鋨酸，梯度乙醇脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，半薄切片定位，超薄切片(70nm)，枸櫞酸鉛和醋

酸鈾染色。透射電鏡下觀察標本。

2 結 果

2.1 施萬細胞的培養(yǎng)與純化 利用施萬細胞和成纖維細胞2種細胞的增殖周期、貼壁速度及表面抗原不同，首先利用藥物除去部分增殖較快的成纖維細胞，進行初步純化。待細胞增殖生長至融合后，仍有大量成纖維細胞存在（圖1A），再利用抗體-補體分別結合除去成纖維細胞，進行深度純化。經(jīng)過以上2步純化，幾乎無雜細胞可見，且細胞排列整齊方向一致（圖1B），S100免疫組化染色結果顯示施萬細胞的純度可達到98%以上（圖1C-E），可用于后續(xù)實驗研究。

圖1 施萬細胞純化前后相差顯微鏡下對比及純化后純度鑒定

2.2 背根節(jié)神經(jīng)元的培養(yǎng)與純化 從孕14～15 d的SD大鼠胚鼠中取背根神經(jīng)節(jié)，用抗有絲分裂試劑尿嘧啶和5-氟尿嘧啶除去植塊中增殖的細胞，如成纖維細胞、施萬細胞等。如圖2顯示了背根神經(jīng)節(jié)從貼壁1 d～16 d后背根節(jié)神經(jīng)元的純化狀態(tài)，在純化了16 d后基本上無雜細胞存在，可用于后續(xù)研究。

圖2 相差顯微鏡下觀察背根節(jié)神經(jīng)元的純化過程

2.3 細胞共培養(yǎng) 將純化后的施萬細胞制成懸液，以105個/mL的密度接種在含背根節(jié)神經(jīng)元的玻片上(圖3A)。貼壁過夜后換成無血清培養(yǎng)基，此時施萬細胞開始增殖以及調整與軸突的方向(圖3B)，為成髓鞘做準備。1周后施萬細胞的增殖達到一定的數(shù)目，然后用含有抗壞血酸的培養(yǎng)基進行誘導培養(yǎng)。約1周后，在相差顯微鏡下可觀察到顏色較深的“條索狀”物(圖3C)。隨著培養(yǎng)時間的延長，在相差顯微鏡下可觀察到更多的“條索狀”物形成(圖3D)。掃描電鏡下可觀察到施萬細胞包繞神經(jīng)元的軸突形成髓鞘(圖5A、C)。培養(yǎng)21 d后，對共培養(yǎng)細胞進行MAG與NF的免疫組化染色(圖4A-F)，結果顯示神經(jīng)元軸突上緊密包繞了數(shù)量可觀的髓鞘，經(jīng)透射電鏡檢測發(fā)現(xiàn)形成致密的板層結構(圖5B、D)。

圖3 相差顯微鏡下觀察施萬細胞與背根節(jié)神經(jīng)元共培養(yǎng)的過程

圖4 共培養(yǎng)21d時髓鞘蛋白MAG免疫熒光染色

圖5 電鏡下觀察共培養(yǎng)成髓鞘的結構

3 討 論

髓鞘化過程在體內受到神經(jīng)、免疫、脈管、內分泌系統(tǒng)等多種系統(tǒng)的調節(jié)。多種影響因素共同作用的結果，導致體內周圍神經(jīng)髓鞘化的微環(huán)境極其復雜，嚴重影響了研究的進度和可靠性。因此，建立穩(wěn)定可靠地體外髓鞘模型是研究成髓鞘機制的重要技術手段。當今大鼠背根節(jié)神經(jīng)元和施萬細胞的共培養(yǎng)模型已被用于各種實驗研究中[9-11]，幾乎所有的共培養(yǎng)都是分為2種細胞分別純化和純化后2種細胞的共培養(yǎng)過程。培養(yǎng)過程中會遇到諸多問題，主要有包被基質的選擇和包被時間、純化試劑的選擇和純化步驟、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、添加試劑及因子的選擇和作用時間等。

本實驗研究結合多種不同的培養(yǎng)方法加以改進，充分利用已有的研究基礎，建立了一個規(guī)范穩(wěn)定的體外成髓鞘培養(yǎng)模型。首先是包被基質的選取，合適的包被結構可以為背根節(jié)神經(jīng)元突起的生長提供一個穩(wěn)定的外環(huán)境。包括Matrigel(基質膠)以及l(fā)aminin(層粘連蛋白)的應用。Matrigel雖有報道可作為包被基質，為神經(jīng)元的生長提供一個良好的環(huán)境[6]。但它也存在許多不足之處：⑴換液時基質膠很容易被吸起導致脫落；⑵基質膠與塑料皿底的結合能力很弱；⑶不同批次的基質膠質量差別較大，因此重復性較差；⑷基質膠在37℃培養(yǎng)15d后，與培養(yǎng)皿的結合不穩(wěn)定，從而很容易脫離下來。Laminin對背根節(jié)神經(jīng)元突起的生長和神經(jīng)元的存活較有利[7]，因為神經(jīng)元體外培養(yǎng)的貼壁能力較差，很容易飄浮而死亡，嚴重干擾了實驗的進行。為了增加神經(jīng)元的穩(wěn)定性，很多學者在使用Laminin包被之前要先用

PLL(左旋)包被[8]。這種包被方式較繁瑣費時，且有文獻報道Laminin影響髓鞘的形成[12]，因此不利于一些實驗的研究。本實驗采用對細胞毒性較小的PDL (右旋)進行包被，對于24孔板中背根節(jié)神經(jīng)元的穩(wěn)定性較好，且操作簡單影響因素單一。

其次是施萬細胞的純化。施萬細胞純化的一個主要困難是大量的成纖維細胞的摻雜，對于怎樣得到純度較高的施萬細胞，現(xiàn)在已有很多方法進行了報道。例如，利用2種細胞的增殖周期不同、貼壁速度不同以及表面抗原不同等[4，13-14]。本實驗結合各方法的利弊在組織消化時間、因子作用時間及純化步驟上加以改進，可得到純度達到98%以上的施萬細胞（圖1B-E所示）。

再者是背根節(jié)神經(jīng)元的純化。據(jù)大鼠胚胎的發(fā)育特點，我們取孕14～15 d的SD大鼠胚胎鼠的背根神經(jīng)節(jié)。不管是在體內還是體外，在這個時期大約有5%的成神經(jīng)細胞仍具有分裂能力，且大部分背根節(jié)神經(jīng)元仍沒有到達對應的靶組織[8]。此時背根節(jié)含有神經(jīng)元、成纖維細胞、施萬細胞、吞噬細胞和各種各樣的其他類型的細胞，這些細胞除神經(jīng)元外均具有較強的分裂增殖能力。因此可用阿糖胞苷、尿嘧啶和5-氟尿嘧啶等抗有絲分裂試劑進行除去[15]。我們分別比較2組有絲分裂抑制劑對增殖細胞以及神經(jīng)元的影響。結果發(fā)現(xiàn)，阿糖胞苷組增殖細胞很快被除去，作用約1周后雜細胞基本不可見，但神經(jīng)元的活力大大降低，與尿嘧啶和5-氟尿嘧啶組相比差很多，以致慢慢死去。尿嘧啶和5-氟尿嘧啶組約2周后雜細胞基本不可見（圖2），且神經(jīng)元突起較長、活力較好，可用于后續(xù)實驗研究。但神經(jīng)元的貼壁能力相比于施萬細胞要差很多，輕微的晃動或換液時液體沖擊力過大都可能導致神經(jīng)元的漂浮，因此，在移動培養(yǎng)板或換液時要盡可能輕柔。

最后是將2種純化后的細胞共培養(yǎng)。當施萬細胞與背根節(jié)神經(jīng)元的軸突接觸時，兩者可相互作用首先引起施萬細胞的大量增殖[16]。體外共培養(yǎng)的條件下，施萬細胞和背根節(jié)神經(jīng)元必須達到合適的密度才能引起施萬細胞的增殖[6]。因此本實驗24孔板我們采用105個/mL密度進行接種，剛貼壁的細胞零散分布，經(jīng)過短暫的調整開始大量增殖且方向一致、排列整齊（圖3）。在此培養(yǎng)過程中，我們分別更換不同的培養(yǎng)基使施萬細胞與神經(jīng)元處于最佳生長環(huán)境。其中B27和ITS的加入，它們包含有很多因子，可以促進膠質細胞的分化和髓鞘的形成。例如胰島素、孕酮、轉鐵蛋白和硒鹽的加入[5]，孕酮可激活髓鞘蛋白P0和PMP的啟動[17]，且可增加P0蛋白和MBP的表達水平[18]。神經(jīng)營養(yǎng)因子對神經(jīng)元的發(fā)育至關重要，它可以控制細胞的存活、分化、突起生長、興奮性、突觸可塑性和功能發(fā)揮等[19]。NGF對軸突信號的控制起重要作用，它可以通過TrkA信號通路控制髓鞘的形成[20]，因此整個神經(jīng)元培養(yǎng)過程中都有NGF的加入?？箟难峥烧T導髓鞘的形成，在未加入抗壞血酸時，可見髓鞘蛋MAG有表達但無其他髓鞘蛋白的表達，且不能形成髓鞘[21-22]。本實驗中，當施萬細胞增殖到一定數(shù)目，加入抗壞血酸約1周，可看到“條索狀”物形成（圖3C），免疫組化結果顯示此“條索狀”物為形成的髓鞘，隨著時間的延長“條索狀”物大量出現(xiàn)。同時我們也在掃描電鏡下觀察到施萬細胞包繞軸突形成髓鞘的現(xiàn)象，以及透射電鏡下檢測到致密的髓鞘板層結構形成。以上檢測結果足以說明體外共培養(yǎng)成髓鞘模型已成功建立。

總之，體外成髓鞘模型是一個有用的實驗工具，該模型的建立能幫助我們更好地理解髓鞘形成的內在分子機制。包括髓鞘形成過程中復雜的轉錄因子調控、髓鞘蛋白的先后表達以及組裝髓鞘所必須的髓鞘蛋白的分選等。除此之外，它還對周圍神經(jīng)脫髓鞘疾病的研究和藥物的分選提供了方便快捷的工具。

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Establishment of a Schwann cell-dorsal root ganglion neuron cocluture model of myelination in the peripheral nervous system

SU Wenfeng,WEI Zhongya,GU Yun,SHEN Yuntian,CHEN Gang
(Key Laboratory of Neuroregeneration,Nantong University,JiangSu 226001)

Objective:To study the mechanism of peripheral nerve myelination,establish a standardized method of Schwann cell and dorsal root ganglion neuron co-culture system of myelination in vitro were established.Methods:SCs were isolated from the sciatic nerves of newborn rat pups(within postnatal 1～3 d).Dorsal root ganglia(DRG)neurons were isolated from the pups of E14～15d SD rats and through the explant culture of DRG.After purification and qualification,these cells were used for co-culture.Then myelin formation were tested by methods of Immune Fluorescent Staining,scanning electron microscopy and transmission electron microscopy.Results:SCs were arranged neatly and their bodies were uniform after purification.The statistical data of immunofluorescence staining showed that the cell purification could reach up to 98% and they could be used for co-culture;DRG neurons were attached to the cell plate steadily,and no hybrid cells could be observed.The immunofluorescence staining of MAG and NF demonstrated that a significant quantity of myelin had formed, and the myelin surrounded the axons tightly;under the scanning electron microscope the process of myelination were obseved while under the transmission electron microscopy showed the typical compact myelin lamellar structure.Conclusions:A stable and reliable model of myelination in vitro has been established and could be used in our subsequent study.

Schwann cells;dorsal root ganglion neurons;myelination；Immune Fluorescent Staining；rat

Q189

A

國家自然科學基金（30800315，31071251）；南通大學校級自然科學類科研基金項目（13Z008）。

2014-07-20

1006-2440（2014）04-0310-06

**[作者簡介]蘇文鳳，女，漢族，山東菏澤人，出生于1986年5月，碩士研究生，助理實驗員。研究方向：膠質細胞功能研究。 通信作者：陳罡，E-mail:chengang6626@gmail.com

髓鞘是指包繞神經(jīng)軸突周圍的一種層狀結構，它既可保護軸突又可加速神經(jīng)沖動的傳導。神經(jīng)髓鞘化是包括蛋白合成、胞吐、胞吞、細胞骨架運動在內的一個復雜的動態(tài)過程，受到神經(jīng)元和成髓鞘細胞之間的精細調節(jié)，涉及到一系列基因和蛋白的變化[1]。髓鞘化異?？蓪е码娦盘栐谏窠?jīng)元間傳遞障礙，是神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘病、腦白質營養(yǎng)不良、阿爾茨海默癥、精神分裂癥等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理基礎[2]。另外，損傷的神經(jīng)纖維再生修復、功能的恢復也依賴于軸突的重新髓鞘化[3]，因此，研究髓鞘化的機制具有重要的臨床意義。體外神經(jīng)元與施萬細胞的共培養(yǎng)成髓鞘模型，一定程度上排除了動物個

體差異、體內其他器官代償作用和局部微環(huán)境變化等體內因素的干擾，是髓鞘化研究的一個有力手段。在體外成髓鞘模型研究中，已有報道表明，由于采用了不同的培養(yǎng)方法導致實驗結果在細胞純度、培養(yǎng)周期、穩(wěn)定性和可重復性等方面都存在較大的差異[4-8]。本研究參閱大量文獻，汲取各方法的優(yōu)勢加以改進，目的是為了建立和推廣標準化、簡約化的模型構建方法，為開展周圍神經(jīng)髓鞘化的主要調節(jié)因素及其作用機制研究提供有效的實驗模型。