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（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510642；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州 510623；3蘇州科技學(xué)院，江蘇蘇州 215009）

荷斯坦奶牛CN和DUMPS遺傳缺陷病的巢式PCR檢測方法的建立和應(yīng)用

代元元1，吳曉薇1，2，洪潔心2，王怡飛1，劉中勇2，趙天楚1，郭 卉3，郭霄峰1

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510642；2.廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東廣州510623；3蘇州科技學(xué)院，江蘇蘇州215009）

為建立荷斯坦奶牛瓜氨酸血癥和尿苷酸核酶缺乏癥兩種遺傳缺陷病的檢測方法，根據(jù)文獻(xiàn)報道的精氨酸琥珀酸合成酶、UMPS基因核苷酸序列，設(shè)計引物，通過條件的優(yōu)化，建立了巢式PCR反應(yīng)體系。結(jié)合PCR產(chǎn)物測序，建立了檢測CN和DUMPS方法。取243份臨床牛血清樣品用巢式PCR檢測并測序，發(fā)現(xiàn)CN野生型238份，CN雜合子型5份，CN突變型0份；DUMPS野生型236份，DUMPS雜合子型5份，DUMPS突變型2份。所建立的巢式PCR方法靈敏、特異，還兼具高通量的特點(diǎn)，適合口岸對荷斯坦奶牛CN和DUMPS遺傳缺陷病的大樣品量檢測。

荷斯坦奶牛；瓜氨酸血癥；尿苷酸核酶缺乏癥；巢式PCR

人工授精和胚胎移植技術(shù)在全球范圍內(nèi)得到推廣和應(yīng)用，顯著提高了奶牛的遺傳性能，但奶牛優(yōu)秀品質(zhì)（胚胎、精液、種牛）的廣泛流通應(yīng)用使得一些隱性遺傳疾病基因擴(kuò)散，對全球各國奶業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。奶業(yè)發(fā)達(dá)國家已建立了完善的遺傳缺陷檢測和監(jiān)控體系，使隱性有害基因頻率逐年降低［1］。因此，建立奶牛遺傳缺陷病的檢測方法具有重要意義。

瓜氨酸血癥（citrullinemia，CN）是荷斯坦牛尿素循環(huán)發(fā)生代謝紊亂的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病，最早于1986年在澳大利亞的荷斯坦牛群中發(fā)現(xiàn)［2］。病牛出生時表現(xiàn)正常， 但不久后出現(xiàn)精神沉郁、步態(tài)紊亂、驚厥、失明等癥狀， 一般出生后 5天死亡， 死亡率達(dá) 100%［3］。CN遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由奶牛第11號染色體（BTA11）上編碼精氨酸琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase， ASS）的基因第5外顯子發(fā)生 C→T 的點(diǎn)突變， 使密碼子 CGA 轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子 TGA，從而其翻譯產(chǎn)物—精氨酸琥珀酸合成酶變成了截短了的 85 個氨基酸的蛋白質(zhì)（ 正常為 412 個氨基酸）， 而失去精氨酸合成酶活性，造成尿素循環(huán)發(fā)生代謝障礙， 進(jìn)而導(dǎo)致血清淀粉酶過高［4-5］。

尿 苷 酸 合 酶 缺 乏 癥（def i ciency of uridine monophophate synthase， DUMPS）是荷斯坦牛胚胎早期死亡的一種常染色體單基因隱性遺傳缺陷病，最早于1987年在美國的荷斯坦牛中發(fā)現(xiàn)［6］。臨床癥狀為血液中瓜氨酸含量升高，尿素循環(huán)受阻引起高氨血癥，從而導(dǎo)致犢牛在出生一周內(nèi)死亡，或者母牛懷孕40天左右時發(fā)生流產(chǎn)［7］。DUMPS的遺傳學(xué)基礎(chǔ)是奶牛1號染色體（BTA1）上的UMPS基因C-末端密碼子405處存在著一個C→T點(diǎn)突變，可導(dǎo)致原來編碼精氨酸的CGA轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a終止密碼子的TGA，導(dǎo)致基因編碼產(chǎn)物催化亞基C-末端缺失76個氨基酸［8］。由于這種蛋白質(zhì)的酶催化功能喪失，造成其作用底物乳清酸的大量積累［9-10］。

針對CN和DUMPS的突變位點(diǎn)具有單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），當(dāng)前主要有PCR-RFLP和AS-PCR兩種方法進(jìn)行檢測方法。另外，還有變性高效液相色譜（DHPLC）、高分辨溶解曲線（HRM）技術(shù)用于檢測CN和DUMPS，因儀器要求較高和材料成本較大，這些未能廣泛應(yīng)用。本研究通過巢式PCR結(jié)合DNA測序的方法對CN和DUMPS兩種常見遺傳缺陷病進(jìn)行檢測，滿足高通量、高靈敏度、高效率的篩查體系要求，對我國荷斯坦奶牛的CN和DUMPS兩種遺傳病的檢測和監(jiān)控，提高種群質(zhì)量具有重要意義。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

隨機(jī)頸靜脈采集江蘇某隔離場243頭荷斯坦奶牛的血液樣本，5mL/頭，置于含肝素鈉抗凝劑的真空管中，搖勻后分裝于另外的離心管中，每管2mL，-20℃凍存?zhèn)洹?/p>

1.2基因組DNA提取

采用Promega Maxwell 16 核酸提取儀進(jìn)行血液基因組DNA的提取，使用配套試劑盒Promega AS1010。程序設(shè)置完成后，將400μL血液樣品加入cartridge的第1個槽，在每個cartridge前面對應(yīng)的洗脫管插槽里放置洗脫管，在洗脫管里加入300μL 洗脫緩沖液，運(yùn)行程序。DNA提取完畢后，將其從洗脫管中轉(zhuǎn)移至指形離心管中，采用超微量核酸蛋白測定儀ND-1000和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因組DNA濃度和純度的檢測。

1.3引物設(shè)計

參考NCBI數(shù)據(jù)庫中ASS基因序列（GenBank Gene ID： 280726）和UMPS基因序列（GenBank Gene ID： 281568）設(shè)計巢式PCR引物。ASS基因第一次PCR引物為CP1（F）、CP2（R），第二次PCR引物為CP3（F）、CP4（R）；UMPS基因第一次PCR引物為DP1（F）、DP2（R），第二次PCR引物為DP3（F）、DP4（R） （表1）。

表1 荷斯坦奶牛ASS基因和UMPS基因的巢式PCR引物

1.4試驗(yàn)設(shè)計

本試驗(yàn)采用高特異性和靈敏性的巢式PCR法對荷斯坦奶牛的ASS基因和UMPS基因進(jìn)行鑒定。首先用引物P1和P2進(jìn)行約30個循環(huán)的擴(kuò)增，然后取第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍作為第二次PCR反應(yīng)的模板，加入引物P3和P4進(jìn)行約30個循環(huán)的擴(kuò)增，將第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，分析測序結(jié)果判定是否攜帶CN或DUMPS有害基因。

1.5巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

1.5.1退火溫度的確定

PCR反應(yīng)體系中其他條件保持不變，設(shè)置梯度退火溫度，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最佳退火溫度。

1.5.2引物濃度的確定

PCR反應(yīng)體系中其他條件保持不變，設(shè)置引物濃度分別為0.04，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2μmol/L，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最佳引物濃度。

1.5.3pfu DNA聚合酶用量的確定

PCR反應(yīng)體系其他條件保持不變，設(shè)置pfu DNA聚合酶分別為0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5μL，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定pfu DNA聚合酶的最佳用量。

1.5.4dNTP 用量的確定

PCR反應(yīng)體系其他條件保持不變（25μL反應(yīng)體系），設(shè)置dNTP分別為0.5，1，1.5，2，2.5，3μL，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定dNTP的最佳用量。

1.5.5延伸溫度的確定

PCR反應(yīng)體系其他條件保持不變（25μL反應(yīng)體系），設(shè)置延伸溫度分別為67，68，69，70，71，72℃，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定最佳延伸溫度。

1.6巢式PCR的敏感性測定

采用微量核酸分析儀檢測樣品DNA濃度。將所提取的DNA樣品作10倍梯度稀釋，然后每個稀釋度取0.5μL為模板，按巢式PCR反應(yīng)條件進(jìn)行兩輪擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.7巢式PCR的特異性試驗(yàn)

用羊、豬、犬、雞的血液DNA提取物為模板，采用相同的巢式PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，每次擴(kuò)增反應(yīng)同時設(shè)雙蒸水作空白對照和荷斯坦奶牛作模板的陽性對照，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后用凝膠電泳檢測。

1.8臨床樣品的巢式PCR檢測

將243份樣品進(jìn)行巢式PCR，產(chǎn)物送北京奧科鼎盛生物科技有限公司測序，測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1?；蚪MDNA提取與鑒定

血液提取的基因組DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可清晰看到牛血液基因組DNA擴(kuò)出的條帶。經(jīng)微量核酸分析儀檢測，牛血液樣品DNA濃度為83 ng/μL。

2.2巢式PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1ASS基因巢式PCR優(yōu)化結(jié)果

第一次PCR反應(yīng)體系為25μL，包括樣品DNA 0.5μL（41.5 ng）、上游引物CP1和下游引物 CP2各 0.5μL（10μmol/L），10×Pfu Buffer 2.5μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5μL、Pfu DNA Polymerase酶（2.5U/ul）0.25μL、ddH20 18.75μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，66.2℃退火30s，70℃延伸20s，30個循環(huán)；70℃再延伸1min，4℃終止反應(yīng)。

第二次PCR反應(yīng)體系為50μL，包括將第一次PCR產(chǎn)物稀釋100倍作為第二次PCR反應(yīng)的模板DNA 1μL、上游引物CP3和下游引物CP4各1μL（10μmol/L）、10×Pfu Buffer 5μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 5μL、Pfu DNA Polymerase酶（2.5U/ul）0.5μL、ddH20 37.5μL。 擴(kuò)增 程 序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，61.2℃退火30s，70.4℃延伸15s，30個循環(huán)；70.4℃再延伸1min，4℃終止反應(yīng)。

2.2.2UMPS基因巢式PCR優(yōu)化結(jié)果

除上游引物和下游引物分別為DP1和DP2外，UMPS基因第一次PCR反應(yīng)體系與ASS基因第一次PCR體系相同，為25μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，51.4℃退火30s，70℃延伸15s，30個循環(huán)；70℃再延伸1min，4℃終止反應(yīng)。

除上游引物和下游引物分別為DP3和DP4外，UMPS基因第二次PCR反應(yīng)體系與ASS基因第二次PCR體系相同，為50μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3min；94℃變性30s，65℃退火30s，68℃延伸15s，30個循環(huán)；68℃再延伸1min，4℃終止反應(yīng)。

2.3巢式PCR的敏感性

經(jīng)微量核酸分析儀檢測樣品DNA濃度為83 ng/μL。樣品DNA依次做10倍梯度稀釋后作為模板進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠電泳檢測， ASS基因和UMPS基因的敏感性結(jié)果分別如圖1和圖2所示。根據(jù)檢測結(jié)果，ASS基因的巢式PCR敏感性為0.83 ng/μL；UMPS基因的巢式PCR敏感性為0.83 ng/μL。

2.4巢式PCR的特異性

以牛、羊、豬、犬、雞的血液DNA提取物為模板，采用同樣的巢式PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3和圖4所示。檢測結(jié)果表明，此巢式PCR檢測方法對荷斯坦奶牛的ASS基因和DUMPS基因具有特異性。

圖1 ASS基因巢式PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖2 UMPS基因巢式PCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖3 ASS基因巢式PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5試驗(yàn)樣品的巢式PCR方法檢測

圖4 UMPS基因巢式PCR特異性試驗(yàn)結(jié)果

用所建立的巢式PCR方法對243份試驗(yàn)樣品進(jìn)行檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物的測序結(jié)果用DNAMAN軟件分析，箭頭所標(biāo)位點(diǎn)為導(dǎo)致CN和DUMPS的SNP位點(diǎn)。測序圖分析：如果測序圖中該SNP位點(diǎn)為單峰C，則為非CN或DUMPS有害基因攜帶者；該SNP位點(diǎn)如果為雙峰，同時含有C和T，則為CN或DUMPS有害基因攜帶者；該SNP位點(diǎn)為單峰T，則為CN或DUMPS患者。ASS基因序列圖如圖5所示，A為野生型、B為雜合子型，未發(fā)現(xiàn)突變型；UMPS基因序列圖如圖6所示，C為野生型、D為雜合子型，E為突變型。

243份樣品中，CN野生型238份，CN雜合子型5份，CN突變型0份；DUMPS野生型236份，DUMPS雜合子型5份，DUMPS突變型2份。

圖5 ASS基因序列圖

圖6 UMPS基因序列圖

3 討論

本研究表明我國荷斯坦奶牛群中存在CN和DUMPS兩種常見隱性遺傳缺陷病。我國每年從美國、加拿大、德國、澳大利亞、新西蘭和烏拉圭等國進(jìn)口大量奶牛優(yōu)秀種質(zhì)，進(jìn)口時檢疫重點(diǎn)在于防止動物傳染病和寄生蟲病的傳入，卻沒有包括防止牛遺傳缺陷的檢疫要求，所以存在的牛遺傳性缺陷攜帶者進(jìn)入我國的風(fēng)險。CN和DUMPS這類單基因隱形遺傳缺陷病，如果兩個雜合子親本配種的后代將有四分之一的概率患病，還有二分之一的概率為有害基因攜帶者，對我國奶牛種群質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重影響，應(yīng)予以充分重視，建立必要的檢測方法。

本研究通過建立CN和DUMPS兩種遺傳缺陷病的巢式PCR擴(kuò)增結(jié)合基因測序的方法，能夠滿足高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的檢測需要。而目前常用的PCR-RFLP方法是通過在突變點(diǎn)處設(shè)計酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增后酶切PCR產(chǎn)物判斷是否含有突變點(diǎn)，該方法引入錯配堿基后，PCR的擴(kuò)增效率會受到影響，另外存在假陽性的可能。ASPCR方法根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計特異的引物，一條鏈與突變位點(diǎn)的一種堿基狀態(tài)互補(bǔ)，另一條鏈按常規(guī)方法進(jìn)行設(shè)計，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的有無判斷是否有堿基的突變，該方法雖操作簡便，成本低，但有時即使引物的3'末端的堿基與模板的堿基不互補(bǔ)，延伸仍然可以進(jìn)行，容易造成結(jié)果的誤判。本研究建立的方法避免了其他方法需要凝膠電泳帶來的低效率和生物污染，滿足了大通量、安全、高效的需要；巢式PCR能夠較好的避免PCR產(chǎn)物濃度過低的發(fā)生，而且第二次PCR能在錯誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低，因此具有高靈敏性；最終結(jié)果的判定是通過基因測序來進(jìn)行的，可直接測出突變位點(diǎn)的堿基變化，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確性，避免假陽性現(xiàn)象。因此，本研究特別是能夠滿足快速、精準(zhǔn)、高通量等特點(diǎn)的進(jìn)出口貿(mào)易過程檢測技術(shù)的需求。

4 結(jié)論

本研究成功設(shè)計了檢測荷斯坦奶牛兩種常見隱性遺傳缺陷病CN和DUMPS的通用引物，并建立了檢測了相關(guān)基因ASS和UMPS基因的巢式PCR檢測體系，測定了該方法的敏感性和特異性，并成功用于243份樣品的檢測。本研究的方法具有高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確度的特點(diǎn)，對建立我國荷斯坦奶牛CN和DUMPS兩種隱性遺傳病的檢測和監(jiān)控體系具有重要意義。

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Development and Application of a Nested PCR Assay for Detection of CN and DUMPS in Holstein Cattle

Dai Yuanyuan1， Wu Xiaowei1，2， Hong Jiexin2， Wang Yifei1， Liu Zhongyong2， Zhao Tianchu1， Guo Hui3， Guo Xiaofeng1
（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， 510623； 3. Suzhou University of Science and Technology， Suzhow， Jiangsu 215009 ）

The aim of the study was to develop a diagnostic method for detecting the two genetic defects---CN and DUMPS in Holstein cattle. Nested PCR primers were designed based on ASS gene and UMPS gene and PCR conditions were optimized. 243 cow blood samples were detected to conf i rm the presence of CN and DUMPS in the cows using the developed Nested PCR method and the PCR products were sequenced. The results showed that 238 cows were without CN， 5 suffered from heterozygote CN， and 236 cows without DUMPS， 5 heterozygote DUMPS and 2 mutant DUMPS respectively. These results indicated that the new assay was suitable to handle large quantity of CN and DUMPS def i cient dairy cows in port quarantine inspection.

Holstein cattle； CN； DUMPS； nested PCR

S856.1；S823

： A

：1005-944X（2014）01-0076-06