，，，，，，，，

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

鹿布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

郝俊偉1，張 云1，楊宇航1，劉紅娜1，王文玉1，張秀麗1，時(shí) 坤2，李建明2，杜 銳2

（1．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118；2．吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

本研究依據(jù)布魯氏菌的特異性基因Omp25c的部分片段作為靶基因，設(shè)計(jì)探針引物，且優(yōu)化了反應(yīng)體系，篩選出引物、探針的最優(yōu)濃度配比。將擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PGEM－T載體上，制備標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立鹿布魯氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性、穩(wěn)定性、敏感性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知該方法的最低檢測(cè)濃度可達(dá)到36拷貝/μL，比常規(guī)PCR靈敏度高出很多。

鹿；布魯氏菌；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

布魯氏菌?。˙rucellosis）是一種嚴(yán)重危害人類健康及畜牧業(yè)生產(chǎn)的人獸共患病，臨床以懷孕母畜流產(chǎn)、空懷不育、子宮炎、乳房炎和公畜發(fā)生睪丸炎、關(guān)節(jié)炎等為特征。一般根據(jù)其宿主的嗜好性分為牛、羊、豬、犬、綿羊附睪和沙林鼠種布魯氏菌6個(gè)種及20個(gè)型[1]。本病分布很廣，嚴(yán)重?fù)p害人畜的健康。布魯氏菌的抵抗力比較強(qiáng)，在土壤、水中和皮毛上能生存較長(zhǎng)時(shí)間，但煮沸后立即死亡，常用濃度的消毒藥在幾分鐘內(nèi)能將其殺死[2]。自1940年間鹿布魯氏菌病被首次確立以來(lái)，鹿布魯氏菌病廣泛發(fā)生于世界各地，給養(yǎng)鹿業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在我國(guó)梅花鹿群中流行的布魯氏菌病經(jīng)吉林省地方病研究所確定為羊型、牛型和豬型三種。還有其他非典型布魯氏菌在鹿群中流行[3]。

診斷技術(shù)一直是布病研究的重要領(lǐng)域[4]，最初檢測(cè)布魯氏菌是采用細(xì)菌培養(yǎng)法，但該法所需時(shí)間長(zhǎng)，操作活菌非常危險(xiǎn)，且需要有經(jīng)驗(yàn)的技術(shù)人員才能完成。根據(jù) GB/T18646—2002 國(guó)標(biāo)規(guī)定，虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、全乳環(huán)狀凝集試驗(yàn)（MRT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）等經(jīng)典試驗(yàn)方法為我國(guó)動(dòng)物布病的診斷技術(shù)[5]。但這些方法有的特異性和敏感性不高、操作繁瑣，在實(shí)際應(yīng)用中不方便。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，診斷布魯氏菌病多采用血清學(xué)方法，但該方法因不能區(qū)分疫苗免疫和自然感染使其運(yùn)用受到限制，其靈敏度及特異性也較差[6-8]，很難真正實(shí)現(xiàn)疾病的準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)和診斷，而基于分子生物學(xué)的方法則能彌補(bǔ)這些方法的不足。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測(cè)方法是近年來(lái)應(yīng)用較為普遍的一種快速檢測(cè)方法，具有快速、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，適用于快速檢測(cè)和排查。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株 Mycobacterium tuberculosis、BCG、BVDV、Brucella suis（S2）、大腸桿菌DH5a均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑以及儀器設(shè)備 PGEM-T SimpleVector購(gòu)自Takara（大連）公司；蛋白酶K購(gòu)自Merck公司；溶菌酶購(gòu)自Bebco公司；Ex TaqTM DNA聚合酶購(gòu)自Takara（大連）公司；DL2000/ DNA Marker購(gòu)自Takara（大連）公司；質(zhì)粒DNA提取小量試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。超微量快速核酸蛋白測(cè)定儀UV-1800（日本島津-GL消耗品銷售公司）；MastercyclerR ep.Realplex4購(gòu)自Eppendorf公司；梯度PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Wealtec公司；高速離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；單道微量可調(diào)移液器，芬蘭百德生物有限公司；其他實(shí)驗(yàn)耗材，杭州AXYGEN生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)方法酚氯仿提取基因組，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2探針引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)布魯氏菌特異性基因Omp25c的保守片段，設(shè)計(jì)特異性探針和引物。探針的5＇端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3＇端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

表1擴(kuò)增OMP25C的引物和探針

1.2.3引物退火溫度的優(yōu)化 退火溫度選擇50～54℃之間，經(jīng)對(duì)5個(gè)溫度的篩選，選取擴(kuò)增效率較高，即最亮條帶。

1.2.4目的基因的克隆 以豬型布魯氏菌疫苗S2株的DNA為模板，用上述引物擴(kuò)增，并進(jìn)行回收、純化、轉(zhuǎn)化、提取重組質(zhì)粒、進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定、測(cè)序。

1.2.5標(biāo)準(zhǔn)品的制備和拷貝數(shù)的計(jì)算 使用UV-1800（島津）對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，OD260值有效范圍在0.2～0.8之間，代入下列公式計(jì)算結(jié)果。若陽(yáng)性質(zhì)粒的OD260值不在有效范圍，可將其適度稀釋。

1.2.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR的體系優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

1.2.6.1探針退火溫度優(yōu)化 將熒光PCR退火溫度分別設(shè)置為53℃、55℃、57℃進(jìn)行擴(kuò)增，確定最佳的退火溫度。

1.2.6.2探針濃度優(yōu)化 將探針濃度分別為100、200、300、400、500 nM進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定探針的最佳濃度。

1.2.6.3引物濃度優(yōu)化 將引物濃度分別為100、200、300、400、500 nM進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定引物的最佳濃度。

1.2.6.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將重組質(zhì)粒做10倍系列稀釋，取稀釋濃度依次為1×106～1×102拷貝/ μL，共五個(gè)稀釋度，每稀釋度設(shè)置一個(gè)對(duì)照組，以雙蒸餾水為模板，設(shè)3組重復(fù)對(duì)照組，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)完畢后，采用隨機(jī)分析軟件，分別錄入相應(yīng)陽(yáng)性質(zhì)?？截悢?shù)，通過(guò)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR的試驗(yàn)評(píng)價(jià)

1.2.7.1特異性試驗(yàn) 提取Mycobacterium tuberculosis、BCG、BVDV、Brucellosis suis（S2）基因組（其中BCDV為提取RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA），并設(shè)置空白對(duì)照，以檢測(cè)該方法的特異性。

1.2.7.2敏感性試驗(yàn) 取Brucellosis suis（S2）Omp25c重組質(zhì)?；蚪MDNA的標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋，以其為模板進(jìn)行PCR。

1.2.7.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將Omp25c特異性基因標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，按照相同反應(yīng)體系重復(fù)做5管，評(píng)價(jià)該方法的穩(wěn)定性。

1.2.8臨床樣品檢測(cè) 取東豐種公鹿場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)分離的布魯氏菌病陽(yáng)性病料10份，疑似病料3份應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1目的基因的克隆 以S2株的DNA為模板擴(kuò)增出的目的片段為149bp（圖1）

圖1 Omp25cPCR擴(kuò)增結(jié)果

2.1.1Omp25c重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，目的片段大小為149bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）

圖2 Omp25c重組質(zhì)粒PCR結(jié)果

2.1.2Omp25c重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與Gen bank上發(fā)表的Omp25c同源性進(jìn)行分析和比對(duì)，同源性為100%。

2.2Omp25c引物退火溫度的優(yōu)化結(jié)果 退火溫度選擇50～54℃之間，經(jīng)對(duì)5個(gè)溫度的篩選，退火溫度為53℃時(shí)，擴(kuò)增效率較高，條帶最亮，且無(wú)非特異性條帶。選擇53℃為退火溫度（圖3）。

圖3 Omp25c PCR退火溫度優(yōu)化結(jié)果

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件 采用25μL的反應(yīng)體系：Premix Ex TaqTMI（2×）12.5μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；熒光探針溶液1μL；標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液2μL；雙蒸餾水8.5μL。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃30s，95℃20s，55℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)，在退火階段檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.4重組質(zhì)粒濃度測(cè)定 經(jīng)計(jì)算獲得，Omp25c重組質(zhì)粒濃度為12.4μg/mL。

2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.5.1Omp25c的溫度優(yōu)化 根據(jù)3組探針濃度對(duì)應(yīng)的Ct值分別為19.21、19.57、20.23以及對(duì)應(yīng)曲線，Omp25c體系探針最佳退火溫度為55℃（圖4、5、6）

圖4 Omp25c退火溫度為53℃的擴(kuò)增曲線

圖5 Omp25c退火溫度為55℃的擴(kuò)增曲線

圖6 Omp25c退火溫度為57℃的擴(kuò)增曲線

2.5.2Omp25c探針濃度的優(yōu)化 據(jù)5組探針濃度對(duì)應(yīng)的Ct值分別為18.79、19.38、19.71、19.91、20.01以及對(duì)應(yīng)曲線，Omp25c體系探針最佳濃度為200nM（圖7）。

圖7 Omp25c熒光PCR不同探針濃度的結(jié)果

2.5.3Omp25c引物濃度的優(yōu)化 根據(jù)5組引物濃度對(duì)應(yīng)的Ct值分別為9.95、11.47、1295、13.08、1351以及對(duì)應(yīng)曲線，Omp25c體系探針引物最佳濃度為200nM（圖8）

圖8 Omp25c熒光PCR不同引物濃度的結(jié)果

2.5.4Omp25c標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將得到的Omp25c作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)5個(gè)不同稀釋度擴(kuò)增的熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后獲得動(dòng)力學(xué)曲線（圖9）以Ct值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)。Omp25c獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖10）。Ct值分別為15.01、18.31、21.57、24.12、26.01，相關(guān)系數(shù)R2值為0.9943（R2＞0.99），可見(jiàn)real-time PCR在稀釋度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

圖9 Omp25c的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖10 Omp25c的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 Omp25c特異性試驗(yàn) 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線和Ct值，Ct值大于35為陰性樣品，Ct值小于30為陽(yáng)性樣品，Ct值在30～35之間為可疑樣品，可疑樣品設(shè)三組重復(fù)組，若三組Ct值均大于30，即判定為陰性樣品。重組質(zhì)粒Ct值為21.68，根據(jù)Ct值判定重組質(zhì)粒為陽(yáng)性，而以Mycobacterium tuberculosis、BCG、BVDV為模板的Ct值均大于35，即為陰性樣品。結(jié)果表明該體系對(duì)布魯氏菌為特異性擴(kuò)增（圖11）。

圖11 Omp25c的特異性擴(kuò)增曲線

2.7 Omp25c敏感性試驗(yàn) 取3.6μL Omp25c的模板DNA，拷貝數(shù)分別為107拷貝/μL 、106拷貝/ μL、105拷貝/μL、104拷貝/μL、103拷貝/μL、102拷貝/μL、101拷貝/μL 、進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，最小檢測(cè)拷貝數(shù)為36Copies/μL（圖12）。

圖12 Omp25c的敏感度擴(kuò)增曲線

2.8Omp25c穩(wěn)定性試驗(yàn) 將Omp25c標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，重復(fù)做4管，Ct值分別為17.93、18.25、18.42、18.54、18.60，五組重復(fù)管中Ct值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差小于15﹪，表明該方法重復(fù)性良好（圖13）。

圖13 Omp25c的重復(fù)性擴(kuò)增曲線

2.9組織樣品 的檢測(cè) 分離東豐種公鹿場(chǎng)的10 份陽(yáng)性病料和3份疑似陽(yáng)性病料，利用本實(shí)驗(yàn)建立的方法進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性及疑似陽(yáng)性全部被檢出為陽(yáng)性（圖14）。

圖14 Omp25c探針檢測(cè)樣本結(jié)果

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選取布魯氏菌高度保守的外膜蛋白Omp25c，并應(yīng)用primer5.0分析軟件設(shè)計(jì)探針和引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為149bp，經(jīng)過(guò)primer5.0分析沒(méi)有發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二聚體等現(xiàn)象出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)二步探針?lè)?，可以?zhǔn)確區(qū)分自然感染和人工免疫，最終進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，設(shè)計(jì)的探針引物在本試驗(yàn)中具有較強(qiáng)的特異性、敏感性、穩(wěn)定性和較好的擴(kuò)增效率。

在應(yīng)用制備的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的過(guò)程中，首先將陽(yáng)性質(zhì)粒的吸光度確定在有效范圍內(nèi)：即OD260在0.2～0.8之間，OD260/OD280比值大于1.90，表明陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的純度較高，且其同源性與檢測(cè)樣品的同源性均為100%。其次，將引物、探針濃度以及退火溫度等體系優(yōu)化后，選取的陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為5個(gè)，采用Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的連續(xù)5個(gè)不同稀釋度擴(kuò)增的熒光信號(hào)，反應(yīng)結(jié)束后獲得動(dòng)力學(xué)曲線，以Ct值為縱坐標(biāo)，不同標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-2.881X +32.628相關(guān)系數(shù)R2=0.9943大于0.99，可見(jiàn)Ct值與其對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值在稀釋度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，從而可對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行定量的測(cè)定分析。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用PCR方法檢測(cè)布魯氏菌所選取的靶基因很多，邱昌慶等[9]建立的套式PCR技術(shù)檢測(cè)布魯氏菌，徐軍等[10]建立的巢式PCR檢測(cè)乳中布魯氏菌，但靈敏性都不及本實(shí)驗(yàn)。Gall D等[11]研究結(jié)果也表明熒光PCR方法檢測(cè)布魯氏菌要比普通PCR和血清學(xué)方法更靈敏、特異。本文所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法可為特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)物鹿布魯氏菌病的普查監(jiān)測(cè)以及對(duì)鹿副產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫，奠定一定的基礎(chǔ)。

[1] Diaz-Aparicio E，Marin C，Alonso-Urmeneta B，et a1．Evaluation of serological tests for diagnosis of Brucella melitensis in-fection of goats[J]．ClinMicrobiol，2004，32（5）：1159-1165．

[2] 許鄒亮，南文龍，周潔，等．布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可視化檢測(cè)方法的建立[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，2011，28（8）：37-40．

[3] 陳偉業(yè)，胡 森，黃克和，等．IS711 和omp2 作為布魯氏菌種屬及種株間分子鑒別診斷標(biāo)記的研究[ J] ．中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2006，28（ 6）：676-680．

[4] Cloeckaert A，Verger JM，Grayon M，et al．Restriction site polymorphism of the genes encoding the major 25 kDa and 36kDa outer-membrane proteins of Brucella [ J ] ．Microbiology，1995，141（ 9）：2111-2121．

[5] 鄭錦玲，蔣成硯，董仲生，等．布魯氏菌病檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展[J]．畜牧獸醫(yī)科學(xué)，2002，22（6）：25-28．

[6] Rajashekara G，Covert J，Petersen E，et al．Genomic island 2 of Brucella melitensis is a major virulence determinant ：functional analyses of genomic is lands [ J ]．J Bacteriol，2008，190（18）：6243-6252．

[7] Wattam A R，Williams K P，Snyder E E，et al．Analysis of ten Brucella genomes reveals evidence for horizontal gene transfer despite a preferred intracellular life style[ J]．J Bacteriol．2009，191（ 11）：3569-3579．

[8] Foster G，Osterm an B S，God froid J，et al．Brucella cetisp. nov. and Brucella pinnipedialis sp． Nov． for Brucella strains with cetaceans and seals as their preferred hosts [ J] ．Int J Syst Evol Microbiol，2007，57（ 11）：2688-2693．

[9] Eskra L，Mathison A，Splitter G．Microarray analysis of mRNA levels from RAW264．7 macrophages infected with Brucella abortus[ J] ．Infect Immun ，2003，71（ 3）：1125-1133．

[10] Halling S M ，Bricker B J． Characterization and occurrence of two repeated palindromic DNA element s of Brucella spp：Bru-RS 1 and Bru-RS2 [ J]．Mol Microbiol ，1994 ，14（4）：681-689．

[11] 張瑞華，黃志琴．淺談奶牛布病檢測(cè)體會(huì)[J]．中國(guó)動(dòng)物檢疫，2005，22（2）：30．

Establishment of a real-time fl uorescent quantitative PCR assay for Detection of Brucella of Deer

Hao Junwei1，Zhang Yun1，Yang Yuhang1，Liu Hongna1，Wang Wenyu1，Zhang Xiuli1，Shi Kun2，Li Jianming2，Du Rui2
（1．College of Animal Science and Technology， Jilin Agricultural University， Changchun 130118；2. College of Traditional Chinese Medicinal Material， Jilin Agricultural University，Changchun 13011）

To aid in the development of a rapid assay to detect Brucella in deer，specif i c probe and primers was optimized based on the conservative Omp25c segment of Brucella and the reaction system was improved for selecting the best concentration of the primers and the probe. The amplif i ed gene was connected to PGEM-T vector，and the developed RTPCR assay was evaluated with regard to its specif i city，replicability and sensitivity via constructing standard samples and standard curve. The result showed that the detecting limit was 36 copies/μL and more sensitive than the general PCR.

deer，Brucella，realtime PCR

S852.614；S858.25

：A

：1005-944X（2014）02-0071-06

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2011BAI03B02-1）；吉林省科技創(chuàng)新人才培育計(jì)劃（20130521023JH）；吉林省科技成果轉(zhuǎn)化促進(jìn)計(jì)劃（20125067）

杜銳