黃 薇，宋永康，*，田寶玉，余 華

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室/福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

酶解制備玉米寡肽的研究

黃 薇1，宋永康1，*，田寶玉2，余 華1

（1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室/福建省精密儀器農(nóng)業(yè)測(cè)試重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/工業(yè)微生物教育部工程研究中心，福建福州350108）

為了高效制備玉米寡肽，本實(shí)驗(yàn)對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行超聲預(yù)處理，以寡肽得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶6種蛋白酶對(duì)其進(jìn)行水解，篩選出堿性蛋白酶為制備玉米寡肽的最適水解用酶。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定制備玉米寡肽的最適工藝條件為：加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應(yīng)溫度57.0℃、反應(yīng)pH為9.0、反應(yīng)時(shí)間3h。在該條件下制備的玉米酶解產(chǎn)物的寡肽得率為34.34%± 0.22%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±1%以?xún)?nèi)。

玉米蛋白粉，寡肽得率，蛋白酶篩選，響應(yīng)面分析

運(yùn)用生物催化技術(shù)將低值植物蛋白資源進(jìn)行高值化、資源化、生態(tài)化利用已成為當(dāng)前食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)[1-3]。我國(guó)是玉米生產(chǎn)消費(fèi)大國(guó)，玉米蛋白粉是玉米淀粉加工中的副產(chǎn)物，其蛋白質(zhì)含量可達(dá)50%以上[4]。由于所含的蛋白質(zhì)缺少賴(lài)氨酸（Lys）、色氨酸（Trp）等人體必需氨基酸，使其在食品中的應(yīng)用受到很大的限制[5-6]?，F(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)研究表明[7-8]，人體對(duì)各種氨基酸的利用程度并不完全受單一限制性氨基酸水平的影響，也并不完全遵守營(yíng)養(yǎng)學(xué)經(jīng)典理論“水桶法則”，相對(duì)分子質(zhì)量低于2ku的寡肽能直接被腸道吸收而被組織利用，并且寡肽具有較強(qiáng)的生物活性和功能特性。研究表明，玉米蛋白粉經(jīng)蛋白酶酶解后，不僅物理性能得到提高，如高溶解性、低黏度、穩(wěn)定性好等，其中的一些肽片段還具有抗氧化性、消除疲勞、解酒保肝、降血壓等獨(dú)特的生理活性[9-11]。因此，如何利用玉米蛋白粉制備玉米寡肽，是促進(jìn)玉米加工工業(yè)改造和升級(jí)急需開(kāi)展的研究。

在肽產(chǎn)品中，肽含量反映的是產(chǎn)品品質(zhì)的一個(gè)重要的技術(shù)指標(biāo)。目前，檢測(cè)肽產(chǎn)品中小分子蛋白含量多采用三氯乙酸（TCA-N）法，其測(cè)定結(jié)果反映的是分子量小于10ku的可溶性肽；然而在肽產(chǎn)品中寡肽含量（分子量≤2ku）指標(biāo)才能真實(shí)反映肽蛋白的品質(zhì)[12]。因此，本研究以玉米蛋白粉為原料，提出以寡肽得率為指標(biāo)，篩選出水解最佳用酶，并對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，制備出高寡肽得率的玉米蛋白酶解產(chǎn)物，旨在為玉米寡肽產(chǎn)業(yè)化的提供理論基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米蛋白粉 粗蛋白含量52.81%，福州科匯生物技術(shù)有限公司；單寧酸、甲醛、氫氧化鈉、鹽酸等試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用蛋白酶的性能 見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用蛋白酶的酶活及性質(zhì)Table.1 Activities and action conditions of several protein enzymes

Kjeltec 2300自動(dòng)定氮儀 瑞典Foss有限公司；KQ-250DB臺(tái)式數(shù)控超聲儀 蘇州江東精密儀器有限公司；TD5A-WS離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器、3HA-C恒溫振蕩器常州國(guó)華電器有限公司；AL204電子分析天平 梅特勒-托利多（上海）有限公司；PHS-3CpH酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米蛋白預(yù)處理實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取一定量玉米蛋白粉置于反應(yīng)杯中，按一定比例加水混勻，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為11，在超聲頻率為40kHz，在超聲功率45W，溫度60℃中超聲30min，作為酶反應(yīng)的底物溶液。

1.2.2 酶解實(shí)驗(yàn) 取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的玉米蛋白溶液，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)體系pH至酶的反應(yīng)pH，加入反應(yīng)所需的蛋白酶，在酶的反應(yīng)溫度下進(jìn)行酶解反應(yīng)，水解至預(yù)定時(shí)間后取出的樣品溶液置85℃水浴鍋中滅酶10min，5000r/min離心20min，所得上清液即為玉米蛋白酶解產(chǎn)物，保存在4℃待分析用。

1.2.3 寡肽得率的測(cè)定 單寧酸溶蛋白含量的測(cè)定：參考DB35/T 1089-2011，利用凱氏定氮法測(cè)定出玉米蛋白酶解液經(jīng)16%單寧酸沉淀后濾液中的蛋白含量，測(cè)得的結(jié)果即為單寧酸溶蛋白含量。

游離氨基酸含量的測(cè)定：參考DB35/T 1089-2011，利用甲醛滴定法，測(cè)定出經(jīng)16%單寧酸沉淀后濾液中的游離氨基酸的含量。

總蛋白含量的測(cè)定：參考GB5009.5-2010，利用凱氏定氮法測(cè)定出玉米蛋白分的蛋白質(zhì)含量。

寡肽得率（%）=（單寧酸溶蛋白含量-游離氨基酸含量）/總蛋白含量×100

1.2.4 蛋白酶的篩選 在預(yù)處理玉米蛋白溶液的基礎(chǔ)上，分別加入不同蛋白酶2000U/g，在表1所示最適反應(yīng)溫度和pH的條件下進(jìn)行水解反應(yīng)，水解時(shí)間6h，每隔1h取樣，測(cè)定水解玉米蛋白過(guò)程中寡肽得率的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn) 根據(jù)堿性蛋白酶水解玉米蛋白過(guò)程中寡肽得率的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果確定水解時(shí)間為3h，研究加酶量、底物濃度、pH、反應(yīng)溫度對(duì)玉米蛋白酶解物產(chǎn)寡肽得率的影響。各因素濃度梯度分別為：加酶量：800、1200、1600、2000、2400、2800、3200、3600、 4000、4400U/g，底物質(zhì)量濃度：2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0g/100mL，pH：6、7、8、9、10，反應(yīng)溫度：45、50、55、60、65℃。

1.開(kāi)發(fā)環(huán)保能源，提供創(chuàng)業(yè)新動(dòng)力。在能源緊缺、環(huán)境污染嚴(yán)重的今天，開(kāi)發(fā)新型環(huán)保替代能源至關(guān)重要。作為大學(xué)生創(chuàng)業(yè)者，要以保護(hù)生態(tài)環(huán)境為中心，在發(fā)展自己事業(yè)的同時(shí)著重保護(hù)環(huán)境，積極尋找和開(kāi)發(fā)環(huán)保能源，不斷創(chuàng)新，要致力于打造零污染，零排放的安全放心企業(yè)。在開(kāi)發(fā)尋找環(huán)保能源的同時(shí)，不斷引入高科技手段，實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代互聯(lián)模式，為創(chuàng)業(yè)提供新途徑，新思路，也為國(guó)家環(huán)境的保護(hù)做出應(yīng)有貢獻(xiàn)。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，固定酶解時(shí)間3h，反應(yīng)pH9.0，運(yùn)用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[13]，考慮堿性蛋白酶水解玉米蛋白粉的加酶量、底物濃度以及反應(yīng)溫度3個(gè)因素對(duì)玉米寡肽得率的影響，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化的因素和水平設(shè)計(jì)Table.2 Factors and levels of Box-Behnken design

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0進(jìn)行極差和方差分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 玉米蛋白酶解過(guò)程中寡肽得率的變化Fig.1 Dynamic changes in yield of oligo-peptide during hydrolysis of corn gluten meal

2.1 不同蛋白酶酶解產(chǎn)物的寡肽得率分析

不同蛋白酶水解玉米蛋白粉過(guò)程的寡肽得率的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。從圖1中可知，在同等酶活力條件下，不同蛋白酶水解玉米蛋白的能力具有顯著差異。堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物寡肽得率最高，水解3h時(shí)寡肽得率可達(dá)22.60%，之后趨于平緩；其他五種蛋白酶在作用1h后，寡肽得率基本恒定，水解6h所得寡肽得率的大小分別為復(fù)合蛋白酶（13.13%）＞風(fēng)味蛋白酶（8.87%）＞中性蛋白酶（8.37%）＞胰蛋白酶（6.67%）＞木瓜蛋白酶（4.87%）。

相比其他幾種蛋白酶，堿性蛋白酶在適宜的條件下對(duì)玉米蛋白具有較強(qiáng)的生物活性，同時(shí)所得酶解產(chǎn)物的寡肽得率最高，在實(shí)際生產(chǎn)中比較切實(shí)可行，因此選擇堿性蛋白酶作為制備玉米寡肽的水解蛋白酶。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 加酶量對(duì)寡肽得率的影響 在底物濃度10.0g/ 100mL、pH8.0、反應(yīng)溫度60℃、酶解時(shí)間3h的條件下，測(cè)定不同加酶量對(duì)玉米寡肽得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。圖2中顯示，在加酶量800～2800U/g范圍中，寡肽得率隨加酶量的增加而上升，當(dāng)加酶量達(dá)到2800U/g時(shí)，寡肽得率為28.19%，之后進(jìn)一步增加酶的用量，寡肽得率變化不明顯，此時(shí)酶分子與底物分子接觸達(dá)到飽和，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最大。綜合考慮酶解反應(yīng)過(guò)程，較適加酶量在2800U/g左右。

圖2 加酶量對(duì)寡肽得率的影響Fig.2 Effect of protease amount on yield of oligo-peptide

2.2.2 底物濃度對(duì)寡肽得率的影響 在酶濃度2800U/g、pH8.0、反應(yīng)溫度60℃的條件下酶解3h，測(cè)定不同底物濃度酶解后的玉米寡肽得率，結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3中可知，在底物濃度較低時(shí)，加大底物濃度，體系寡肽得率不斷增加；當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到8.0g/100mL時(shí)達(dá)到最高值，為29.33%，繼續(xù)增加底物濃度，所得寡肽得率出現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)?？赡茉蚴窃诘孜餄舛容^低時(shí)，底物濃度的增加可以加大酶與底物的結(jié)合，使得產(chǎn)物增加，但當(dāng)?shù)孜餄舛冗^(guò)高，體系流動(dòng)性較差，不利于蛋白質(zhì)的充分溶解和分散，使得酶與底物的接觸機(jī)會(huì)也逐漸降低。綜合考慮，確定底物適宜濃度在8.0g/100mL左右。

圖3 底物濃度對(duì)寡肽得率影響Fig.3 Effect of substrate concentration on yield of oligo-peptide

2.2.3 pH對(duì)寡肽得率的影響 在底物濃度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、反應(yīng)溫度60℃、酶解時(shí)間3h的條件下，測(cè)定不同pH對(duì)玉米寡肽得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4中可知，pH在6.0～10.0的范圍內(nèi)，寡肽得率的變化趨勢(shì)為先增大后減小，在pH9.0時(shí)達(dá)到最高，為31.89%。酶的催化能力與pH密切相關(guān)，環(huán)境pH能夠影響酶分子的構(gòu)象和酶與底物的解離狀態(tài)，過(guò)高或過(guò)低均對(duì)酶促反應(yīng)不利，因此選定pH9.0作為水解的適宜pH。

圖4 pH值對(duì)寡肽得率的影響Fig.4 Effect of pH value on yield of oligo-peptide

2.2.4 溫度對(duì)寡肽得率的影響 在底物濃度8.0g/ 100mL、加酶量2800U/g、pH為9.0、酶解時(shí)間3h的條件下，測(cè)定不同溫度對(duì)玉米寡肽得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以知，當(dāng)反應(yīng)溫度較低（45～55℃）時(shí)，體系寡肽得率隨溫度升高而逐漸上升，于55℃時(shí)達(dá)到最大值34.03%，而當(dāng)反應(yīng)溫度較高（55～65℃）時(shí)，則體系寡肽得率隨溫度升高而逐漸下降。環(huán)境溫度直接影響蛋白酶的酶活力，且在溫度較低時(shí)，溫度升高能加劇蛋白質(zhì)分子的擴(kuò)散促使反應(yīng)加快，但當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)易引起維持酶分子結(jié)構(gòu)次級(jí)鍵解體，導(dǎo)致酶失活。故確定較適反應(yīng)溫度在55℃左右。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)寡肽得率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3 酶解工藝條件優(yōu)化

2.3.1 多元二次回歸方程的建立與分析 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取X1加酶量、X2底物濃度、X3反應(yīng)溫度為自變量，以Y寡肽得率為響應(yīng)值，開(kāi)展N=17的三因素三水平的Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到寡肽得率擬合回歸方程為：

Y=34.09-0.97X1-0.97X2+1.57X3-0.64X1X2+ 0.18X1X3+0.67X2X3-0.61X12-2.98X22-1.23X32

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)矩陣和響應(yīng)數(shù)據(jù)的實(shí)測(cè)值與擬合值Table.3 Test scheme and its observation and simulation values in BOX-Behnken design

表4 二次多項(xiàng)模型方差分析表Table.4 Analyse of variance for the regression quadratic model equation of Box-Behnken design

由表4的方差分析可知，所得二次多項(xiàng)模型極顯著（p值＜0.0001），且失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著（p值=0.4092），表明該模型選擇正確；多元相關(guān)系數(shù)為R2=0.9885，校正決定系數(shù)R2Adj=0.9738，表明此回歸模型能解釋97.38%響應(yīng)值的變異；模型的信噪比（Adeq precision）為27.301（＞4），說(shuō)明本模型擬合3個(gè)因數(shù)與響應(yīng)值之間的關(guān)系是可行的。從3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的影響來(lái)看，一次項(xiàng)X1、X2、X3對(duì)寡肽得率均有極顯著的影響，且影響順序?yàn)閄3＞X2＞X1，二次項(xiàng)X12、X22、X32以及交互項(xiàng)X1X2、X2X3對(duì)寡肽得率影響顯著，二次項(xiàng)X1X3對(duì)寡肽得率影響不顯著，這表明響應(yīng)值的變化比較復(fù)雜，各實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響呈二次關(guān)系，且3因素之間存在交互作用。

圖6 底物濃度和加酶量交互影響的響應(yīng)面圖Fig.6 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzyme concentration on yield of oligo-peptide

圖7 加酶量和反應(yīng)溫度交互影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for enzyme concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

圖8 底物濃度和反應(yīng)溫度交互影響的響應(yīng)面圖Fig.7 Rresponse surface of mutual-influence for substrate concentration and enzymolysis temperature on yield of oligo-peptide

2.3.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 分別將模型中的X1、X2、X3中的其中一個(gè)因素固定在0水平，得到另外兩個(gè)因素的交互作用對(duì)響應(yīng)值Y的子模型，根據(jù)模型分別繪制響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖6～圖8。從圖中可知，固定反應(yīng)溫度X3=55℃，在X1=2648.64U/g、X2=7.84g/100mL時(shí)，寡肽得率達(dá)到最大值34.50%；固定底物濃度X2=8.0，在X1=2658.11U/g、X3=56.76℃時(shí)，寡肽得率達(dá)到最大值34.89%；固定加酶量X1=2800U/g，在X2=7.81、X3= 56.83℃時(shí)，寡肽得率達(dá)到最大值34.62%，從圖6～圖8中可以看出，除了加酶量外，隨著各因素值的增加，Y值均呈先增大后減小的拋物線(xiàn)變化趨勢(shì)。利用Design-Expert8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行最優(yōu)化分析，得到當(dāng)X1=2659.71U/g、X2=7.96g/100mL、X3=56.74℃時(shí)，寡肽得率可以達(dá)到最大值34.8947%。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 考慮到成本及實(shí)際操作方便，選擇的最優(yōu)酶解條件為堿性蛋白酶加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應(yīng)溫度57.0℃，依據(jù)該條件所得的寡肽得率預(yù)測(cè)值為34.8851%。為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ皖A(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在最優(yōu)酶解條件下水解，做3組平行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行模型驗(yàn)證，得到實(shí)測(cè)寡肽得率的結(jié)果分別為34.11%、34.38%和34.54%，與預(yù)測(cè)值的誤差均在±1%以?xún)?nèi)，表明了所得模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際酶解情況。

3 結(jié)論

3.1 對(duì)復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等6種商業(yè)化蛋白酶酶解玉米蛋白的寡肽得率進(jìn)行分析。其中堿性蛋白酶相比其他幾種酶，效率較高，能獲得較高的寡肽得率，是制備玉米寡肽的最佳蛋白酶。

3.2 堿性蛋白酶水解玉米蛋白制備寡肽，體系寡肽得率與加酶量、底物濃度及反應(yīng)溫度顯著相關(guān)，方差分析顯示各因素對(duì)玉米蛋白酶解產(chǎn)物的寡肽得率的影響順序?yàn)椋悍磻?yīng)溫度＞底物濃度＞加酶量，建立的回歸模型可信。

3.3 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析得到堿性蛋白酶酶解玉米蛋白制備寡肽的較佳工藝條件為：加酶量2660U/g、底物濃度8.0g/100mL、反應(yīng)溫度57.0℃、反應(yīng)pH為9.0、反應(yīng)時(shí)間3h。在該條件下制備的玉米酶解產(chǎn)物的寡肽得率為34.34%±0.22%，與理論預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差在±1%以?xún)?nèi)。

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Enzymatic preparation of corn oligo-peptide

HUANG Wei1，SONG Yong-kang1，*，TIAN Bao-yu2，YU Hua1
（1.Central Laboratory，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory of Precise Measurement of Agricultural，F(xiàn)uzhou 350003，China；2.College of Life Sciences/Engineering Research Center of Industrial Microbiology of Ministry of Education，F(xiàn)ujian Normal University，F(xiàn)uzhou 350108，China）

In order to prepare corn oligo-peptide efficiently，corn gluten meal was pretreated by ultrasonic. Using the yield of oligo-peptide as the evaluation indicator，Alcalase was screened out from the following six kinds of protease-Protamex，Alcalase，F(xiàn)lavourzyme，Protex7L，Trypsin and Papain.Single factor experiment and response surface methodology were used for optimizing the enzymatic hydrolysis conditions in this study.The optimum hydrolysis conditions were designated as enzyme concentration of 2660U/g，substrate concentration 8.0g/100mL，Enzymolysis temperature of 57.0℃，pH 9.0，and enzymolysis time of 3h.Under these conditions，yield of corn oligo-peptide could reached up to 34.34%±0.22%，which coincided with predictive values with the relative error of less than±1%.

corn gluten meal；yield of oligo-peptide；protease screening；response surface methodology

TS210.9

A

1002-0306（2014）06-0202-05

2013－07－31 *通訊聯(lián)系人

黃薇（1986-），女，助理研究員，研究方向：食品生物技術(shù)。

福建省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2010NZ0002-1）；福建省公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)（2011R1027-1）。