石秀錦，魏國義，林 陽，鐘 逾，張海波，孟 旭，秦 英，李 驍，白玉國，鄭青敏，周 洋，賈一新（.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 0009；.毅新興業(yè)（北京）科技有限公司，北京 00080；.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心外科，北京 0009）

PXR基因多態(tài)性與心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期環(huán)孢素血藥濃度的相關(guān)性

石秀錦1，魏國義1，林 陽1，鐘 逾2，張海波3，孟 旭3，秦 英1，李 驍1，白玉國1，鄭青敏1，周 洋1，賈一新3（1.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院藥劑科，北京 100029；2.毅新興業(yè)（北京）科技有限公司，北京 100080；3.首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院心外科，北京 100029）

目的：探討心臟移植患者術(shù)后口服免疫抑制劑環(huán)孢素的血藥濃度與PXR基因多態(tài)性的相關(guān)性。方法：應(yīng)用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)對59例心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期患者的PXR基因型進行檢測，全自動化學免疫分析儀測定環(huán)孢素的血藥濃度，并通過統(tǒng)計學分析PXR各單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點基因型對環(huán)孢素血藥濃度的影響。結(jié)果：PXR基因篩選出的8個Tag SNP位點次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中中國人的數(shù)據(jù)相近。對于59名穩(wěn)定期心臟移植患者PXR基因8個Tag SNP中，僅攜帶PXR rs1523127（C 24381 A）位點AA型基因的患者血藥濃度及校正血藥濃度明顯低于CA型，CA型又低于CC型患者，差異均具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05）。其他7個Tag SNP rs3814056T ＞ G、rs7643645A ＞ G、rs11917714C ＞ T、rs2276705C ＞ A、rs2472681T ＞ C、rs2472682C ＞ A、rs4440154C ＞ T各基因型組間環(huán)孢素血藥濃度的差異均無統(tǒng)計學意義。結(jié)論：PXR rs1523127（C 24381 A）基因型與心臟移植穩(wěn)定期患者環(huán)孢素血藥濃度顯著相關(guān)，提示該SNP可能會在環(huán)孢素個體化用藥中發(fā)揮重要作用。

飛行時間質(zhì)譜技術(shù)；心臟移植；環(huán)孢素；血藥濃度；孕烷X受體；基因多態(tài)性

心臟移植是治療各種原因所致終末期心臟病的有效方法。免疫抑制治療是關(guān)系到心臟移植術(shù)后能否長期生存的關(guān)鍵因素之一[1]。環(huán)孢素（cyclosporine A，CsA）因具有較強的免疫活性，已成為廣泛用于器官移植術(shù)后抗排異反應(yīng)的基礎(chǔ)免疫抑制劑。該藥在發(fā)揮療效的同時，表現(xiàn)出明顯的藥代動力學個體差異以及狹窄的治療窗。因此，需要對服藥患者定時進行CsA血藥濃度監(jiān)測，以保證最佳治療效果并最大限度地減少排斥反應(yīng)及毒副作用。目前，臨床多根據(jù)體質(zhì)量確定CsA的初始劑量，維持劑量依據(jù)CsA全血谷濃度（C0）、峰濃度（C2）及患者情況進行調(diào)整。但上述方法難以針對不同個體最佳初始劑量作出準確、有效的判斷。隨著藥物基因組學的發(fā)展，通過基因水平檢測信息對藥物體內(nèi)代謝強度進行預(yù)判已受到廣大學者的關(guān)注。本研究旨在探討CsA 代謝酶CYP3A4以及轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白（P-gp）編碼基因共同的上游調(diào)控基因孕烷X受體（pregnane X receptor，PXR）的基因多態(tài)性對心臟移植術(shù)后穩(wěn)定期患者CsA血藥濃度的影響，旨在為臨床合理用藥提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2004年1月– 2012年12月在北京安貞醫(yī)院接受心臟移植手術(shù)并門診隨訪的患者。入選條件為心臟移植術(shù)后接受環(huán)孢素、嗎替麥考酚酯和糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫抑制方案，漢族，術(shù)后時間≥6個月，環(huán)孢素服用≥2個月，未聯(lián)合使用CYP3A的誘導(dǎo)劑或抑制劑，且臨床相應(yīng)研究資料以及DNA標本可以獲得。依據(jù)以上入選條件共篩選了59例心臟移植患者參與該項研究。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準，并與患者或其家屬簽署知情同意書。

1.2 標本采集與分離

隨訪時，收集患者清晨服藥前靜脈血進行血藥濃度監(jiān)測，留取監(jiān)測后乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的靜脈全血2 mL，應(yīng)用全基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化有限公司），按照說明書從1 mL外周血中提取白細胞基因組DNA，溶解于0.1×TE緩沖液中（10 mmol·L-1Tris-HCL，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0），于– 20 ℃冰箱儲存?zhèn)溆?。使用前?jīng)DU 800 spectrophotometer 檢測，D（260）/D（280）均在1.6 ～2.0 范圍內(nèi)，DNA濃度均在10 ng·mL-1以上。

1.3 環(huán)孢素血藥濃度的測定

CsA血藥濃度首次測定在患者規(guī)律服用CsA 2 ～6 d后進行，術(shù)后3個月內(nèi)每月監(jiān)測2 ～ 3次，3個月后每月監(jiān)測1次。若血藥濃度過高或偏低，則調(diào)整CsA劑量，并于調(diào)整劑量后2 ～ 6 d再予測定，直至達到治療濃度范圍。每次均在清晨服藥前取外周靜脈血2 mL，置于EDTA-K抗凝管，應(yīng)用AxSYM全自動化學免疫分析儀（美國雅培公司）測定CsA的谷濃度（C0）。CsA血藥濃度標準曲線范圍為5 ～ 800 μg·L-1。根據(jù)個體服藥劑量，計算出血藥濃度與劑量比，以此作為校正血藥濃度。

1.4 標簽SNP的選擇

使用HapMap數(shù)據(jù)庫的人類全基因組的SNP基因型數(shù)據(jù)進行標簽位點的選擇。標簽位點篩選遵循連鎖不平衡值（r2）＞ 0.8的原則，即標簽位點與所代表的位點之間有足夠強的連鎖不平衡（r2值＞ 0.8）[2]。再使用Haploview 4.2程序?qū)腍apMap下載的中國漢族人群（CHB）基因型數(shù)據(jù)進行標簽位點的選擇，選擇的位點僅限次要等位基因頻率（The minor allele frequency, MAF） ＞ 0.01，本研究共從PXR基因相關(guān)序列中找到8個Tag SNP。

1.5 SNP質(zhì)譜分型

應(yīng)用Sequenom公司的基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜系統(tǒng)（MALDI-TOF MS）中的iPLEX試劑盒進行SNP基因型分析[3]。其步驟簡述如下：1）多重PCR引物設(shè)計與擴增：5 μL反應(yīng)體系中包括1×反應(yīng)緩沖液，10 ng基因組DNA，0.5 U熱啟動Taq DNA聚合酶（HotStarTaq，Qiagen公司），500 μmol·L-1脫氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），每個位點100 nmol·L-1上游和下游引物，置于384孔板中，使用ABI-9700 PCR擴增儀，于94 ℃15 min活化DNA 聚合酶后，于94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共循環(huán)45次。PCR產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。2）去除未反應(yīng)的引物和dNTPs。PCR擴增后，在反應(yīng)體系中加入2 μL 0.3 U 蝦堿性磷酸酶（SAP），于37 ℃下恒溫20 min進行多余堿基消減反應(yīng)，再置于85 ℃放置5 min進行滅活。3）單堿基延伸PCR反應(yīng)。應(yīng)用iPLEX試劑盒。調(diào)節(jié)延伸引物的濃度，降低質(zhì)譜峰圖的背景噪音后，在9 μL反應(yīng)體系中加入100 μmol·L-1dNTP 0.2 μL、0.05單位的上述DNA聚合酶0.04 μL、及625 ～1 250 nmol·L-1的延伸引物。先置PCR擴增儀94 ℃ 30 s，再進行延伸PCR反應(yīng)循環(huán)：置94 ℃ 5 s，5 ×（52 ℃ 5 s + 80 ℃ 5 s），該循環(huán)共200次；最后置72 ℃延伸3 min。置4 ℃保存。4）純化的延伸反應(yīng)產(chǎn)物進行MALDITOF-MS分析：上述樣品應(yīng)用6 mg樹脂脫鹽處理后，應(yīng)用自動機械臂點樣儀轉(zhuǎn)移至Sequenom的384孔質(zhì)譜芯片上，另在384孔質(zhì)譜芯片上設(shè)置4個孔的重復(fù)質(zhì)控樣品。在質(zhì)譜分型系統(tǒng)中對點樣后的質(zhì)譜芯片進行基因分型。5）數(shù)據(jù)采集和基因型分析：不同的波譜峰形狀代表電荷標記的不同質(zhì)量。如果產(chǎn)物中存在兩個單核苷酸多態(tài)性位點，每一個位點有一個等位基因，那么該等位基因是純合子；如果質(zhì)譜儀捕捉到4個不同的波譜峰，那么兩個單核苷酸多態(tài)性是雜合子。通過操作界面Typer 4.0軟件包讀取質(zhì)譜峰圖，獲得基因型數(shù)據(jù)。

1.6 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 一般情況

59例心臟移植患者中，男性50例，女性9例，平均年齡（42.47±14.53）歲，平均體質(zhì)量（67.37± 15.11） kg，平均身高（171.76±8.59） cm。

2.2 PXR基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)信息

PXR基因SNP的rs編號、染色體位置和等位基因頻率見表1。所有位點均通過了Hardy-Weinberg平衡檢驗（P ＞ 0.05）。本次實驗數(shù)據(jù)PXR 8個Tag SNP位點次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中中國人的數(shù)據(jù)相近。

表1 PXR基因8個單核苷酸多態(tài)性（SNP）的相關(guān)信息Tab 1 Information about 8 genotyped SNP of PXR gene

2.3 PXR基因分型結(jié)果及其對心臟移植患者環(huán)孢素藥物濃度的影響

對于59名穩(wěn)定期心臟移植患者PXR基因8個Tag SNP中，僅攜帶PXR rs1523127（C 24381 A）位點AA型基因的患者血藥濃度及校正血藥濃度明顯低于CA型，CA型又低于CC型患者，差異均具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。其他7個Tag SNP rs3814056T ＞ G、 rs7643645A ＞G、rs11917714C ＞ T、rs2276705C ＞ A、rs2472681T ＞ C、rs2472682C ＞ A、rs4440154C ＞ T各基因型組間環(huán)孢素血藥濃度的差異均無統(tǒng)計學意義。詳見表2。

表2 PXR基因8個SNP基因分型及其對心臟移植患者環(huán)孢素血藥濃度的影響Tab 2 Genotype frequencies of 8 Tags SNP of PXR gene and its in fl uence on the cyclosporine blood concentration of heart transplant patients

3 討論

環(huán)孢素主要經(jīng)CYP3A4、CYP3A5代謝，同時也是P-gp的底物，CYP3A5呈現(xiàn)顯著的個體差異，與CsA 首過清除有緊密關(guān)系，多藥耐藥酶基因1（multidrug resistance gene 1, MDR1）編碼CsA的轉(zhuǎn)運蛋白P-gp，其外顯子上的突變使得P-gp的表達和功能發(fā)生改變[4]。故小腸壁上皮細胞中P-gp活性及CYP3A4、CYP3A5基因多態(tài)性對CsA血藥濃度有重要的影響[5]。近年來，核受體作為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在藥物代謝酶及轉(zhuǎn)運蛋白的表達調(diào)控中所起的重要作用逐漸被認識。其中， PXR屬核受體NR1I亞家族，由NR1I2基因編碼，是機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，能同時調(diào)控代謝酶CYP3A4、CYP3A5以及轉(zhuǎn)運體P-糖蛋白等多種基因的表達[6]，因此NRlI2的基因多態(tài)性也可能通過影響CYP3A4、CYP 3A5、MDRl的表達從而間接影響環(huán)孢素的藥動學。

本研究結(jié)果顯示：59例心臟移植受者PXR 8個Tag SNP位點次要等位基因頻率（MAF）與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中報道的中國人的次要等位基因頻率相近。其中，PXR 7個Tag SNP位點的基因多態(tài)性對心臟移植受者CsA血藥濃度均無影響；僅PXR rs1523127（C 24381 A）基因多態(tài)性對CsA血藥濃度有明顯影響，擬取得相同的血藥濃度，攜帶突變型純合子AA型患者要比突變型雜合子AC型和野生型CC型服用更高劑量的CsA。PXR rs1523127（C 24381A）位于5′非編碼區(qū)（untranslated region，UTR），突變頻率為31.2%，與NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中報道的中國人的突變頻率相近，而C24381A的突變頻率在中國健康漢族人與已報道的白人和美國黑人有顯著性差異[7]。已有研究表明該位點與CYP3A4的表型及腸道P-gp含量相關(guān)[8]，進而影響CsA的血藥濃度。Press等[9]對33例腎移植患者ABCB1、CYP3A4、CYP3A5和PXR（包括PXR C24381A）基因多態(tài)性對CsA藥代動力學的影響進行了非線性混合效應(yīng)模型研究，發(fā)現(xiàn)所選基因?qū)sA清除率沒有很大的影響。國內(nèi)目前未見關(guān)于PXR C24381A對環(huán)孢素藥動學影響的報道。李澎灝等[10]對60例腎移植受者PXR與他克莫司藥動學的相關(guān)性進行了研究，發(fā)現(xiàn)PXR C24381A（rs1523127）基因多態(tài)性突變頻率為25%，對他克莫司血藥濃度亦有明顯影響，攜帶突變型純合子AA型患者要比突變型雜合子AC型和野生型CC型服用更高劑量的他克莫司，研究結(jié)論與本研究一致。由此可見，CsA劑量調(diào)整的谷濃度是否會受到PXR C24381A基因多態(tài)性的影響，結(jié)果存在爭議，這可能與實驗病例較少，PXR基因多態(tài)性存在很大的種族差異性以及該基因并非是影響CsA代謝唯一因素等有關(guān)，仍需要對不同種族之間進行大樣本對比研究。

藥物基因組學為基因?qū)騻€體化藥物治療提供了新策略，用基因參數(shù)來預(yù)測免疫抑制劑的最合適服用初始劑量將會促進藥物最佳臨床療效發(fā)揮。雖然它不能替代傳統(tǒng)TDM，但對基因型探尋可以確定小部分患者對藥物的高敏感型或者毒副反應(yīng)的危險度，最終對于移植受者基因型可以添加到在選擇免疫抑制劑方案中的己知危險因素中，為移植患者合理有效的個體化應(yīng)用免疫抑制劑提供了更多的信息。

[1]鄭奇軍，蔡振杰，俞世強，等.心臟移植術(shù)后的免疫抑制治療[J].第四軍醫(yī)大學學報，2004，25（10）：926-927.

[2]Carlson CS, Eberle MA, Rieder MJ, et al. Selecting a maximally informative set of single-nucleotide polymorphisms for association analyses using linkage disequilibrium[J]. Am J Hum Genet, 2004, 74(1): 106-120.

[3]Buetow KH, Edmonson M, MacDonald R, et al. High-throughput development and characterization of a genomewide collection of gene-based single nucleotide polymorphism markers by chip-based matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(2): 581-584.

[4]Wang Y, Wang C, Li J, et al. Effect of genetic polymorphisms of CYP3A5 and MDR1 on cyclosporine concentration during the early stage after renal transplantation in Chinese patients cotreated with diltiazem[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2009, 65(3): 239-247.

[5]謝宇，宋洪濤，王慶華，等.CYP3A5*3和MDR1 G2677T/A基因多態(tài)性對腎移植患者環(huán)孢素A血藥濃度及療效的影響[J].中國藥學雜志，2011，46（20）：1591-1596.

[6]Orans J, Teotico DG, Redinbo MR. The nuclear xenobiotic receptor pregnane X receptor: recent insights and new challenges[J]. Mol Endocrinol, 2005, 19(12): 2891-2900.

[7]Lamba J, Lamba V, Schuetz E. Genetic variants of PXR (NR1I2) and CAR (NR1I3) and their implications in drug metabolism and pharmacogenetics[J]. Curr Drug Metab, 2005, 6(4): 369-383.

[8]Sv?rd J, Spiers JP, Mulcahy F, et al. Nuclear receptor-mediated induction of CYP450 by antiretrovirals: functional consequences of NR1I2 (PXR) polymorphisms and differential prevalence in whites and sub-Saharan Africans[J]. J Acquir Immune Defic Syndr, 2010, 55(5): 536-549.

[9]Press RR, Ploeger BA, den Hartigh J, et al. Explaining variability in ciclosporin exposure in adult kidney transplant recipients[J]. Eur J Clin Pharmacol, 2010, 66(6): 579-590.

[10]李澎灝，王金平，李雯，等.孕烷X受體基因多態(tài)性對腎移植受者他克莫司濃度/劑量比的影響[J].中國臨床藥理學雜志，2013，29（6）：446-448.

Relationship between genetic polymorphisms of PXR and cyclosporine blood concentration of stable heart transplant recipients

SHI Xiu-jin1, WEI Guo-yi1, LIN Yang1, ZHONG Yu2, ZHANG Hai-bo3, MENG Xu3, QIN Ying1, LI Xiao1, BAI Yu-guo1, ZHENG Qing-min1, ZHOU Yang1, JIA Yi-xin3(1. Department of Pharmacy, Beijing Anzhen Hospital Af fi liated to the Capital Medical University, Beijing 100029, China; 2. Bioyong Technologies Inc., Beijing 100080, China; 3. Department of Cardiac Surgery, Beijing Anzhen Hospital Af fi liated to the Capital Medical University, Beijing 100029, China)

Objective:To investigate the correlation between gene polymorphisms of pregnane X receptor (PXR) and cyclosporine blood concentration in heart transplant patients.Methods:MassARRAY was applied to detect the PXR genotypes of 59 stable heart transplant recipients. AxSYM fully-automated chemistry immune analyzer was used to detect the blood concentration of cyclosporine. And then the in fl uence of the genotypes of PXR single nucleotide polymorphism (SNP) on cyclosporine trough blood concentration was analyzed by statistical method.Results:The minor allele frequency (MAF) in 8 tags of PXR SNP of 59 patients obtained in this study was similar with that in NCBI's dbSNP database of Chinese population. The blood concentration and corrected concentration of cyclosporine in PXR rs1523127 (C 24381 A) AA patients were obviously lower than those of CA patients, and those of CA patients were obviously lower than those of CC patients (P ＜ 0.05). There was no statistical difference in the cyclosporine blood concentrations in patients with the other seven PXR Tag SNP (rs3814056T ＞ G, rs7643645A ＞ G, rs11917714C ＞ T, rs2276705C ＞ A, rs2472681T ＞ C, rs2472682C ＞ A, rs4440154C ＞ T).Conclusion:There was signi fi cant correlation between PXR rs1523127 (C24381A) genotype and cyclosporine blood concentration in stable heart transplant recipients, which indicated that this SNP may play an important role in the individual application of cyclosporine.

MassARRAY; Heart transplantation; Cyclosporine; Blood drug concentration; Pregnane X receptor (PXR); Genetic polymorphism

R979.5

A

1672 – 8157(2014)03 – 0152 – 04

2014-02-20

2014-04-08）

魏國義，女，主任藥師，研究方向：臨床藥學與藥事管理。E-mail：weiguoyi2013@163.com

石秀錦，女，主管藥師，研究方向：臨床藥學與個體化用藥。E-mail：xiujinshi@163.com