李 科，洪志鵬，沈麗達(dá)，謝 琳，胡鳳娣

非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC)占新發(fā)肺癌的75%～80%，雖然各種治療手段不斷改善，但其預(yù)后依然很差。因此，弄清肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制對(duì)于提高療效及預(yù)測(cè)預(yù)后意義重大。CD151是4跨膜超家族 (transmember 4 super family，TM4SF家族)重要成員之一，TM4SF的一個(gè)明顯生物學(xué)特征是可以與自身或其他膜蛋白如整合素、EGFR和c－Met等酪氨酸激酶受體等結(jié)合形成四跨膜網(wǎng)絡(luò)，在細(xì)胞黏附、增殖、融合，腫瘤的生長(zhǎng)、遷移及血管生成中起重要作用。TM4SF成員CD9、CD82已被認(rèn)為是抑癌基因產(chǎn)物，而新近卻發(fā)現(xiàn)CD151與腫瘤發(fā)展呈正相關(guān)。目前關(guān)于CD151及整合素α3β1蛋白在NSCLC中的表達(dá)及與術(shù)后生存期的相關(guān)性研究尚少，為此本研究探討兩者在NSCLC中的表達(dá)及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科2006－01－01—2011－12－31手術(shù)切除并經(jīng)常規(guī)病理證實(shí)的NSCLC標(biāo)本78例，選取同期22例肺良性病變組織 (15例肺結(jié)核、7例炎性假瘤)作對(duì)照。78例NSCLC病理特征見表1。根據(jù)2004年WHO肺癌分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)分型，根據(jù)2011年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò) (NCCN)修訂的NSCLC TNM分期進(jìn)行分期?；颊咝g(shù)前均未做過(guò)化療或放療。60.3%(47/78)的患者術(shù)后予以鉑類為基礎(chǔ)的2～6周期的化療，部分患者合并局部放療。納入標(biāo)準(zhǔn)要求患者術(shù)后生存3個(gè)月以上，術(shù)后5年內(nèi)肺癌是其惟一死因。隨訪截止日期為2012－04－30，隨訪期間有3例失訪。

表1 CD151和整合素α3β1蛋白在不同病理特征NSCLC中的表達(dá)情況Table 1 Expression of CD151and integrin α3 β1in different pathological features of NSCLC

1.2 方法 采用免疫組化法檢測(cè)CD151和整合素α3β1蛋白的表達(dá)。鼠抗人CD151單抗和整合素α3β1蛋白單抗均購(gòu)自生工生物工程 (上海)有限公司。石蠟組織切片常規(guī)脫蠟，水化;過(guò)氧化氫甲醇阻斷過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鈉抗原熱修復(fù);滴加羊非免疫血清，濕盒內(nèi)37℃孵育 20 min;CD151按 1∶200 稀釋，整合素α3β1蛋白按1∶300稀釋的一抗，孵育后4℃過(guò)夜;復(fù)溫后滴加二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育30 min;DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固、觀察。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)見棕褐色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞。陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［1－2］，部分修改，每個(gè)切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，取5個(gè)視野的算術(shù)平均值。截?cái)嘀等?0%，即≥50%為陽(yáng)性，＜50%為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan－Meier生存曲線比較采用log－rank檢驗(yàn)，影響生存的因素分析采用Cox多因素回歸法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD151及整合素α3β1蛋白在NSCLC和肺良性病變組織中的表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示CD151蛋白陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕褐色顆粒狀表達(dá)于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)中 (見圖1A～C)，在NSCLC和肺良性病變組織的表達(dá)陽(yáng)性率分別為57.7%(45/78)、18.2%(4/22)，二者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=10.72，P=0.001)。整合素α3β1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中 (見圖1D～F)，在NSCLC和肺良性病變組織的表達(dá)陽(yáng)性率分別為51.3%(40/78)、22.7%(5/22)，二者間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=5.653，P=0.017)。

2.2 CD151及整合素α3β1蛋白的表達(dá)與NSCLC臨床病理特征的關(guān)系 CD151蛋白的表達(dá)與患者的性別、年齡、是否吸煙、T分期、TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、PS評(píng)分無(wú)關(guān) (P＞0.05);而與病理分型、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)有關(guān) (P＜0.05，見表1)。α3β1蛋白表達(dá)與患者的性別、年齡、T分期、TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、PS評(píng)分無(wú)關(guān) (P＞0.05);而與是否吸煙、病理類型及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)有關(guān) (P＜0.05，見表1)。

2.3 CD151蛋白的表達(dá)與NSCLC預(yù)后的關(guān)系 78例患者有3例失訪。CD151蛋白陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)組生存曲線間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.004，見圖2)。將性別、年齡、是否吸煙、病理類型、T分期、淋巴結(jié)數(shù)、TNM分期、腫瘤細(xì)胞分化程度、PS評(píng)分、CD151蛋白表達(dá)、α3β1蛋白表達(dá)11個(gè)因素進(jìn)行Cox模型分析，結(jié)果顯示，CD151蛋白是影響NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 (P=0.014，見表2)。

表2 NSCLC預(yù)后因素多變量Cox回歸分析Table 2 Multivariate regression analysis in predicting survival of 75 patients with NSCLC

2.4 CD151蛋白與整合素α3β1蛋白的相關(guān)性 NSCLC中CD151蛋白與整合素α3β1蛋白的表達(dá)呈正相關(guān) (r=0.464，P＜0.05，見表3)。

圖1 CD151蛋白和α3β1蛋白在NSCLC中的表達(dá)情況 (SP，×400)Figure 1 Expression of CD151and integrin α3 β1in NSCLC

圖2 CD151蛋白陽(yáng)性和陰性表達(dá)的NSCLC患者Kaplan－Meier生存曲線Figure 2 Kaplan－Meier survival curve of patients with NSCLC

表3 NSCLC中CD151和整合素α3β1蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 3 Correlation between the expression of CD151and integrin α3β1in NSCLC

3 討論

CD151基因位于人染色體 11p15.5［3－4］，是 TM4SF 成員中的惟一癌基因。CD151與其他分子 (整合素、生長(zhǎng)因子受體及其他TM4SF成員)等結(jié)合形成四跨膜網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控細(xì)胞的黏附、遷移、增殖及血管形成等病理生理過(guò)程［5］。研究證實(shí)，CD151在多種腫瘤中廣泛表達(dá)，且與腫瘤的惡性進(jìn)展、預(yù)后有密切關(guān)系。Hashida等［6］發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌CD151陽(yáng)性患者3年生存率明顯較CD151陰性患者低;Ang等［7］研究發(fā)現(xiàn)，CD151在前列腺癌組織的表達(dá)明顯高于前列腺肥大組織，且分化好的前列腺癌CD151的表達(dá)明顯低于分化差的前列腺癌。目前為止，發(fā)現(xiàn)CD151增高的惡性腫瘤有黑色素瘤［8］、胰腺癌［9］、肝癌［2，10］、透明細(xì)胞腎癌［11］、子宮內(nèi)膜癌［12］、膠質(zhì)細(xì)胞瘤［13］等。

本研究發(fā)現(xiàn)，CD151在NSCLC中的表達(dá)顯著高于肺良性病變組織;在腺癌組織中的表達(dá)低于鱗癌組織，CD151表達(dá)的患者預(yù)后較不表達(dá)者差，與國(guó)外Tokuhara等［14］及國(guó)內(nèi)安舟等［15］的研究結(jié)果基本吻合。最近的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，CD151在NSCLC中的高表達(dá)與患者總生存 (OS)和無(wú)病生存 (DFS)降低相關(guān)，是肺腺癌患者OS的獨(dú)立預(yù)后因素。本研究提示CD151可能在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用。

整合素為細(xì)胞黏附分子 (CAM)家族的重要成員之一，整合素 β6、α3、α4、α5、β1、α3β1、α1β1、β8等的表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。此外，同一組織中不同病理類型的細(xì)胞表面所表達(dá)的整合素也可能不同。Adachi等［16］用免疫組化法檢測(cè)88例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的NSCLC組織，發(fā)現(xiàn)整合素α5β1蛋白過(guò)度表達(dá)與正常表達(dá)各占50%，前者5年生存率顯著低于后者。Macias－ Perez等［17］研究證實(shí)，整合素 α1β1在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，與Kras一起可促進(jìn)NSCLC的生長(zhǎng)。本研究發(fā)現(xiàn)整合素α3β1蛋白在NSCLC組織中的表達(dá)高于肺良性病變組織，與是否吸煙、病理類型、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)數(shù)目有關(guān)。這表明整合素α3β1蛋白的異常表達(dá)可能參與了腫瘤的進(jìn)展。本研究并未完全重復(fù)其他學(xué)者的研究結(jié)果，考慮與患者輔助治療不規(guī)范、單一的蛋白分析、人群間及樣本的隨機(jī)誤差、回顧性研究的性質(zhì)以及免疫組化技術(shù)的固有缺陷有關(guān)。

最近研究表明，CD151能與多種整合素亞型特異性結(jié)合形成CD151－整合素復(fù)合體，是整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜連接器。CD151可通過(guò)胞內(nèi)的C－末端募集細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)分子于整合素分子富集的膜內(nèi)表面，形成CD151－整合素－信號(hào)分子復(fù)合物并激活信號(hào)分子，從而在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)而產(chǎn)生一系列的生物效應(yīng)，CD151－整合素復(fù)合物的完整是CD151參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移所必需的。Yauch 等［18］報(bào)道，抗 CD151抗體和抗整合素α3β1蛋白抗體作用后的白細(xì)胞在纖維粘連蛋白上的連接減少88% ～92%，表明CD151－整合素α3β1復(fù)合物在細(xì)胞遷移中起關(guān)鍵作用。Nishiuchi等［19］研究 CD151－ α3β1復(fù)合物中CD151的作用時(shí)發(fā)現(xiàn):在以單克隆抗體8C3(可分離 CD151與整合素)阻斷 CD151與α3β1的結(jié)合后，α3β1與其配體的結(jié)合也下降，細(xì)胞的移動(dòng)下降，同時(shí)其以RNAi敲除 CD151后也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果。Lammerding等［20］對(duì) CD151－ 整合素 α6β1的研究發(fā)現(xiàn)，CD151可增強(qiáng)α6β1蛋白與其配體層粘連蛋白－1之間的結(jié)合，從而加強(qiáng)細(xì)胞在層粘連蛋白－1基膜上的移動(dòng)。Yang等［21］研究發(fā)現(xiàn)，CD151通過(guò)CD151－整合素復(fù)合物激活磷酸化的ERK，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究中，整合素α3β1蛋白的表達(dá)與CD151的表達(dá)呈正相關(guān)，這在一定程度上也說(shuō)明CD151的功能與整合素偶聯(lián)在一起，CD151和整合素α3β1在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮協(xié)同作用;聯(lián)合檢測(cè)CD151及整合素α3β1的表達(dá)可能為判斷NSCLC的生物學(xué)行為、預(yù)后提供參考依據(jù)。CD151基因的發(fā)現(xiàn)和相關(guān)功能的研究為包括NSCLC在內(nèi)的腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的研究提供了新的思路。隨著對(duì)CD151功能的進(jìn)一步探索研究，其有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)之一。

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