焦海春，張俊威，崔彥芬

（北京市豐臺(tái)區(qū)南苑醫(yī)院 1．心內(nèi)科，2．婦產(chǎn)科，北京100076）

慢性心力衰竭（Chronic Heart Failure，CHF）是由多種原因引起心臟結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致心室射血和（或）充盈功能低下，并出現(xiàn)相應(yīng)臨床表現(xiàn)的綜合征，它是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿和死亡原因。心衰的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，越來(lái)越多的證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)的持續(xù)激活、自身抗體的產(chǎn)生等機(jī)制在心衰發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［1］。Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞及Treg細(xì)胞的發(fā)育及相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，分別受轉(zhuǎn)錄因子 T－bet、GATA－3和Foxp3的調(diào)控。IFN－γ、IL－4分別為Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子。本研究通過(guò)檢測(cè)T－bet、GATA－3及Foxp3mRNA 的表達(dá)水平及IFN－γ、IL－4的水平，進(jìn)而探討Th1和Th2型細(xì)胞及Treg細(xì)胞在慢性心衰發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 資料與方法

1．1 研究對(duì)象 選擇2010年9月～2012年9月在我院心內(nèi)科住院的慢性心力衰竭患者62例為對(duì)象，其中男34例（54．8%），女28例（45．2%），年齡36～84歲，平均年齡（66±8）歲。62例患者中缺血性心臟病（IHD組）30例，非缺血性心臟?。∟IHD組）32例，包括高血壓性心臟病20例，擴(kuò)張性心肌病8例，酒精性心肌病4例。診斷依據(jù)病史、體格檢查、常規(guī)生化檢查、心電圖、胸部X片、超聲心動(dòng)圖以及心導(dǎo)管檢查等。入選標(biāo)準(zhǔn)：①確診為CHF至少3個(gè)月。②NYHA分級(jí)為Ⅱ～Ⅳ級(jí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①急慢性感染、炎癥性疾病患者。②自身免疫性疾病患者。③近期不穩(wěn)定性心絞痛及急性心肌梗死患者（3個(gè)月內(nèi)）。④風(fēng)濕性疾病近期有風(fēng)濕活動(dòng)（3個(gè)月內(nèi)）。⑤糖尿病、甲亢或其他內(nèi)分泌疾病患者。⑥近期使用影響免疫反應(yīng)藥物（如皮質(zhì)類固醇）者。⑦嚴(yán)重肝腎功能不全者。⑧惡性腫瘤患者。⑨妊娠或哺乳患者。對(duì)照組42例來(lái)自本院體檢中心的健康體檢者，其中男16例，女14例，年齡35～82歲，平均年齡（63±8）歲，年齡及性別構(gòu)成與病例組比較均無(wú)顯著性差異（P＞0．05），具有可比性。

1．2 主要試劑和儀器 RNA提取試劑Trizol Reagent（Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega司），F(xiàn)QPCR試劑盒購(gòu)自美國(guó) Gibco－BRL，ABI 7300Real－Time PCR System （美 國(guó) ABI 公 司），ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D systems公司。

1．3 PCR 引物 目的基因T－bet上游：5′－GTTCCCATTCCTGTCATTTACT－3′，下游：5′－TAGGAGAGGAGAGTAGTGATCT－3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 片 段 長(zhǎng) 度580bp；目的基因GATA－3，上游：5′－CAGGGAGTGTGTGAACTGT－3′，下游：5－TTTTTGCACTTTTTGGATTTGC－3′擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度351bp；目的基因Foxp3，上游：5′－CTCCAGAGAGAGATGGTACAG－3′，下 游： 5′－CAGTGGTAGATCTCATTGAGTG－3′，擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 片 段 長(zhǎng) 度 398bp。內(nèi) 參 基 因：GAPDH（甘 油 醛－3－磷 酸 脫 氫 酶 glyceraldehydes－3－dehydrogenase），上游引物5′－CCGAGGGCCCACTAAAGG－3′，下 游 引 物 5′－GCTGTTGAAGTCACAGGAGACAA－3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度226bp。

1．4 檢測(cè)方法 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均抽取外周靜脈血6ml，EDTA 抗凝后分離PBMC，提取總 mRNA，－80℃ 低溫凍存?zhèn)溆?，用于T－bet、GATA－3和FoxP3的測(cè)定。cDNA合成按照試劑盒說(shuō)明書操作，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42℃50min，95℃5min。RT－PCR檢測(cè)由ABI7300Real－Time PCR System 完 成；反應(yīng) 條 件：96℃4min，然后三步反應(yīng)：94℃30s，58℃30s，55℃30s，共40個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第三步即55℃30s收集熒光信號(hào)，得到Ct值。由軟件得出RQ值，即是所檢測(cè)目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1．5 血漿IFN－γ和IL－4的檢測(cè) 血漿IFN－γ和IL－4的測(cè)定，采用ELISA雙抗夾心法，操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果用±s表示，兩組間RQ值比較用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 T－bet、GATA3及Foxp3mRNA 表達(dá)見(jiàn)表1。

表1顯示，慢性心衰患者T－bet mRNA表達(dá)水平高于對(duì)照組，GATA－3表達(dá)水平及Foxp3mRNA表達(dá)水平均低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。

表1 慢性心衰患者和正常對(duì)照組外周血中T－bet、GATA3及Foxp3 mRNA的表達(dá)（±s）Table 1 The expression of T－bet，GATA－3and Foxp3mRNA in PBMC from patients with CHF and controls

表1 慢性心衰患者和正常對(duì)照組外周血中T－bet、GATA3及Foxp3 mRNA的表達(dá)（±s）Table 1 The expression of T－bet，GATA－3and Foxp3mRNA in PBMC from patients with CHF and controls

組別 T－bet RQ GATA－3RQ Foxp3RQ CHF組1．43±0．32 0．58±0．29 0．42±0．11對(duì)照組0．82±0．26 1．12±0．32 1．38±0．36

2．2 血漿IFN－γ和IL－4表達(dá)水平見(jiàn)表2。表2顯示，慢性心衰組血漿中IFN－γ水平及IFN－γ／IL－4高于對(duì)照組（均P＜0．01）。

表2 慢性心衰患者和正常對(duì)照組血漿IFN－γ和IL－4的表達(dá)水平（±s）Tab．1 The level of IFN－γand IL－4in patients with CHF and controls

表2 慢性心衰患者和正常對(duì)照組血漿IFN－γ和IL－4的表達(dá)水平（±s）Tab．1 The level of IFN－γand IL－4in patients with CHF and controls

組別 IFN－γ（pg／mL） IL－4（pg／mL） IFN－γ／IL－4 CHF組74．36±8．45 36．32±3．65 2．26±1．21對(duì)照組48．84±0．56 45．36±0．42 1．05±0．36

3 討論

心力衰竭是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿，其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，神經(jīng)體液機(jī)制、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡等參與了其發(fā)病。大量的基礎(chǔ)和臨床研究的數(shù)據(jù)表明，與慢性心衰同時(shí)激活的免疫和炎癥介質(zhì)在心衰的發(fā)病、發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中起著重要作用［2］。Thl、Th2型細(xì)胞是CD4＋T輔助細(xì)胞的兩個(gè)亞群。Thl細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL－2、IFN－γ等，具有免疫殺傷作用。Th2細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL－4、IL－5、IL－6、IL－9、IL－l0 及 IL－18，具 有 免 疫 抑 制 作用［3］。正常情況下，Thl／Th2細(xì)胞因子相互介導(dǎo)，相互抑制，處于平衡狀態(tài)，當(dāng)兩者之間的比例失衡時(shí)往往會(huì)引起多種疾病的發(fā)生。Thl及其分泌的細(xì)胞因子代表促炎作用，Th2及其分泌的細(xì)胞因子代表抑炎作用［4］。Treg細(xì)胞是維持機(jī)體免疫平衡功能的T細(xì)胞，它在體內(nèi)外通過(guò)抗原非特異性或特異性擴(kuò)增，下調(diào)效應(yīng)性免疫細(xì)胞的功能并削弱其增殖能力，來(lái)抑制或控制機(jī)體免疫應(yīng)答的程度［5］。轉(zhuǎn)錄因子T－bet正調(diào)控Th1細(xì)胞的發(fā)育，GATA－3正調(diào)控Th2細(xì)胞的發(fā)育，二 者最終 決 定 Th0向 Th1／Th2 的轉(zhuǎn)化［6］。Foxp3特異的高表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并且介導(dǎo)Treg細(xì)胞在胸腺的發(fā)育、外周的表達(dá)及功能的維持，可反映Treg細(xì)胞的活性水平。

T－bet mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，而GATA－3mRNA低于正常對(duì)照組，慢性心衰患者T－bet／GATA－3高于正常對(duì)照組，T－bet／GATA－3的失衡提示慢性心衰患者外周血Th1細(xì)胞亞群占優(yōu)勢(shì)。慢性心衰患者，Th1細(xì)胞分泌的IFN－γ明顯升高，而Th2細(xì)胞分泌的IL－4明顯下降，也提示慢性心衰患者外周血Th1細(xì)胞亞群占優(yōu)勢(shì)。Treg細(xì)胞具有維持自身免疫耐受和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的功能。Yndestad等［7］對(duì)慢性心力衰竭患者作了T細(xì)胞免疫表型和細(xì)胞因子的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)心力衰竭患者T細(xì)胞的CD25表型顯著增加，推測(cè)T細(xì)胞的激活可能作為炎性反應(yīng)的獨(dú)立因素。本研究中慢性心衰患者Foxp3mRNA表達(dá)水平降低，Treg細(xì)胞功能失常，減弱了機(jī)體對(duì)效應(yīng)性CD4＋T細(xì)胞的抑制作用，使Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)相對(duì)增強(qiáng)。Treg細(xì)胞的功能異?？赡軈⑴c了慢性心衰的發(fā)病機(jī)制。

4 結(jié)論

慢性心衰患者T－bet／GATA－3及IFN－γ／IL－4升高，F(xiàn)oxp3降低，提示Th1細(xì)胞亞群表達(dá)升高，Th2型細(xì)胞及CD4＋、CD25＋調(diào)節(jié)性T細(xì)胞減少，細(xì)胞免疫異常可能參與慢性心衰的發(fā)病機(jī)制。

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