張占國 吳延誨 梁慧芳 張必翔

腫瘤干細(xì)胞是一群處于腫瘤細(xì)胞之中，具有自我更新能力及增殖分化能力的細(xì)胞亞群，往往具有一定的干細(xì)胞標(biāo)記物及特異性的分子表達(dá)水平[1-2]。Sox2是一種早已被很多人熟知的干細(xì)胞相關(guān)性轉(zhuǎn)錄因子，其在正常細(xì)胞及組織發(fā)育及腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及再生過程中起到非常重要的作用[3-10]。在此我們探討sox2在肝細(xì)胞癌中的作用及機制。

材料與方法

一、實驗材料及細(xì)胞培養(yǎng)

人肝細(xì)胞癌PLC/PRF/5細(xì)胞購于美國ATCC，此細(xì)胞系應(yīng)用于很多研究當(dāng)中[11-13]。培養(yǎng)液成分為DMEM加10%胎牛血清(Gibco)，37 ℃ 5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱無菌培養(yǎng)?？贵wsox2抗體購于BD公司，β-actin抗體購于Sigma，辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗兔二抗購于Santa Cruz公司。

二、Western blot技術(shù)

長至70%～80%滿地細(xì)胞經(jīng)胰酶消化或成球細(xì)胞經(jīng)磷酸緩沖液(PBS)洗滌后加細(xì)胞裂解液在冰面上裂解30 min。裂解得到的蛋白樣品加入上樣緩沖液后沸水煮5 min。20 μg樣品上樣于每個孔。經(jīng)SDS分離膠電泳分離后轉(zhuǎn)于PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后，一抗孵育過夜。再經(jīng)過二抗孵育后ECL發(fā)光檢測信號強度。

三、腫瘤成球?qū)嶒?/p>

PLC/PRF/5細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后充分打散，濾過200目濾網(wǎng)得到單細(xì)胞懸液，懸浮生長于低黏附細(xì)胞培養(yǎng)6孔板中，每組3個復(fù)孔。培養(yǎng)液為無血清的DMEM/F12加1∶50 B27，20 ng/ml EGF，20 ng/ml bFGF及1X胰島素。懸浮培養(yǎng)10 d后在Gel counter機器上檢測腫瘤成球的大小及多少進(jìn)行比較。

四、動物及分組

25只4～6周齡雌性SPF級裸鼠購于北京華阜康公司，并飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)動物實驗中心SPF級動物房內(nèi)。隨機分成5組，每組5只用于皮下成瘤實驗。

五、裸鼠皮下成瘤實驗

PLC/PRF/5細(xì)胞及成球細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后與matrigel(BD)按1∶1混合后終濃度為1×107/ml。1×106個細(xì)胞/100 μl細(xì)胞注射到裸鼠后腿部皮下，長到可以觸摸到的腫瘤后，開始每周測量一次，腫瘤體積按照腫瘤長徑×短徑2×π/6計算。

六、數(shù)據(jù)處理

結(jié) 果

一、PLC/PRF/5細(xì)胞sox2基因敲減水平檢測

對PLC/PRF/5細(xì)胞sox2基因慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)行敲減，用于慢病毒包裝的質(zhì)粒是我們實驗室自己構(gòu)建的可誘導(dǎo)性敲減shRNA質(zhì)粒，敲減結(jié)果見圖1。PLC/PRF/5成球細(xì)胞比其2D培養(yǎng)細(xì)胞的sox2表達(dá)相比明顯提高(圖1)。

二、細(xì)胞成球試驗

表明敲減sox2的PLC/PRF/5細(xì)胞成球能力明顯低于PLC/PRF/5原代細(xì)胞。100 ng/ml多氧西林誘導(dǎo)敲減sox2的PLC/PRF/5細(xì)胞成球數(shù)量大約為(13.0±7.1)個/5000細(xì)胞和(51.0±11.7)個/5000細(xì)胞，明顯低于未加多氧西林誘導(dǎo)的對照組。10 ng/ml誘導(dǎo)組與對照組相比無明顯差異；50 ng/ml誘導(dǎo)組在成球大小明顯小于對照組。(圖1、2)。

三、在體內(nèi)試驗中sox2促進(jìn)腫瘤形成能力

sox2敲減后的PLC/PRF/5細(xì)胞進(jìn)行裸鼠皮下成瘤實驗。實驗結(jié)果表明sox2敲減組腫瘤形成能力明顯低于野生型組，P<0.01。由成球細(xì)胞形成的腫瘤明顯大于對照未敲減細(xì)胞，P<0.05(圖3)。

圖1 PLC/PRF/5細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sox2敲減質(zhì)粒慢病毒系統(tǒng)后，加100μg/L多氧西林繼續(xù)培養(yǎng)24、48及72h后，利用West?ernblot方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中sox2的表達(dá)水平；利用Westernblot技術(shù)檢測PLC/PRF/5細(xì)胞與成球細(xì)胞中sox2的表達(dá)水平

討 論

在細(xì)胞調(diào)控過程中轉(zhuǎn)錄因子作為信號通路的最終部分在正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中均起到非常重要的作用。sox2是某些轉(zhuǎn)錄因子核心組成部分，負(fù)責(zé)維持正常胚胎細(xì)胞及胚胎性癌細(xì)胞的自我更新能力及未分化狀態(tài)[14]。在正常細(xì)胞中，其作用常表現(xiàn)為維持細(xì)胞干性、促進(jìn)細(xì)胞自我更新及維持分化潛能。在腫瘤細(xì)胞中，則表現(xiàn)為無限的增殖能力及自我更新和分化成癌細(xì)胞的能力。正因為如此，sox2一直被認(rèn)為是致癌性的轉(zhuǎn)錄因子和關(guān)鍵癌癥干細(xì)胞(CSC)的生物標(biāo)記物。這一現(xiàn)象已經(jīng)被廣泛發(fā)現(xiàn)與具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞之中[15]。sox2在肝癌中的研究相對來說較少，在肝癌干細(xì)胞中的作用研究更是少之又少[15-17]。此外， sox2是成體干細(xì)胞表型維持的一個重要因素，并在細(xì)胞命運決定中扮演主要角色。腫瘤的惡性增生表明sox2很有可能是一個中心調(diào)控因子，其作用涉及到腫瘤形成能力、腫瘤細(xì)胞具有干性的亞群，這一直被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞特性[18]。這一特性可以促發(fā)多種腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[19-20]。在正常干細(xì)胞中被sox2調(diào)控的很多基因很多情況下是發(fā)生異常調(diào)控的，異常調(diào)控發(fā)生后導(dǎo)致各種疾病及腫瘤發(fā)生。

腫瘤細(xì)胞成球?qū)嶒炇亲钤鐟?yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)現(xiàn)及培養(yǎng)的方法，后來被廣泛應(yīng)用于各種類型正常干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的干性能力評估[21-22]。其中乳腺細(xì)胞成球試驗、肝癌細(xì)胞成球試驗及胰腺癌細(xì)胞成球試驗已經(jīng)成功運用于研究這三種腫瘤干細(xì)胞干性的標(biāo)準(zhǔn)方法[23-24]。在無血清的培養(yǎng)環(huán)境中，具有自我更新能力的腫瘤細(xì)胞或者正常組織細(xì)胞存活下來，并實現(xiàn)自我復(fù)制增殖，在懸浮生長環(huán)境中由單個細(xì)胞分裂產(chǎn)生的細(xì)胞往往會成球狀排列，這也是成球試驗的一個特性。在此，我們利用肝癌細(xì)胞成瘤實驗證實sox2對肝細(xì)胞癌干細(xì)胞的調(diào)控功能，發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的sox2可以明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的干性。而具有干性的肝癌細(xì)胞球sox2表達(dá)明顯高于正常細(xì)胞系。在此我們的這一發(fā)現(xiàn)說明，具有干性的成球細(xì)胞具有較高的sox2表達(dá)，這一點從某種意義上驗證了sox2在肝癌干性細(xì)胞的維持中發(fā)揮作用。

圖2 A所示為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后PLC/PRF/5細(xì)胞成球?qū)嶒灥拇硇詧D片，黑色短線條代表長度為500μm；B柱狀圖所示為成球的數(shù)量多少；C柱狀圖為成球的半徑的統(tǒng)計分析

圖3 Sox2對腫瘤形成能力的影響，誘導(dǎo)敲減sox2的小鼠灌胃多氧西林組小鼠皮下腫瘤生長速度明顯高于喂水的對照組(A)；PLC/PRF/5成瘤細(xì)胞與普通二維培養(yǎng)細(xì)胞的腫瘤形成能力比較(B)

可誘導(dǎo)性基因敲減系統(tǒng)是我們實驗室建立的一套以慢病毒為載體的穩(wěn)定的基因敲減系統(tǒng)。載體質(zhì)粒上具有識別多氧西林等一些小分子化合物的靶點，與此類化合物結(jié)合后轉(zhuǎn)錄因子被激活，進(jìn)而發(fā)生基因轉(zhuǎn)錄，表達(dá)敲減目的基因的發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的干擾RNA(shRNA)。穩(wěn)定表達(dá)的shRNA進(jìn)入細(xì)胞中與特異性基因的特殊區(qū)段結(jié)合，影響該基因的翻譯，進(jìn)而發(fā)揮基因敲減作用。我們利用可誘導(dǎo)性敲減系統(tǒng)對人肝細(xì)胞癌PLC/PRF/5細(xì)胞中sox2進(jìn)行敲減，敲減后的細(xì)胞經(jīng)過多氧西林誘導(dǎo)，以Western blot技術(shù)檢測其敲減效果良好。并且發(fā)現(xiàn)敲減后細(xì)胞成球能力明顯減弱。此外，動物實驗表明sox2敲減后細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力明顯降低。本研究僅在現(xiàn)象水平上對sox2在肝癌腫瘤相關(guān)干性維持中的作用加以說明，沒有深入探討機制，這也是我們以后的研究目標(biāo)所在。我們的結(jié)果為后續(xù)機制的研究提供了必不可少的強有力的事實依據(jù)。綜上所述，sox2可能在肝癌干細(xì)胞特性維持中發(fā)揮一定作用，是否為主要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，我們尚需進(jìn)一步研究。

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