枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽及降解硫苷的研究

何榮海，蔣 邊，朱培培，丁文慧，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)多肽及降解硫苷的研究

何榮海，蔣 邊，朱培培，丁文慧，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇省農(nóng)產(chǎn)品物理加工重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

實驗以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為發(fā)酵菌株、菜籽粕為原料，菜籽多肽得率和硫代葡萄糖苷（硫苷）降解率為發(fā)酵菜籽粕品質(zhì)的主要評價指標，通過單因素實驗及Box-Behnken響應面分析法對固態(tài)發(fā)酵制備菜籽多肽的工藝進行研究，得到最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間為70h，液料比為1.3∶1mL/g，接種量為15%，發(fā)酵溫度為31℃，此時多肽得率、硫苷降解率可達15.94%、62.14%，兩者的綜合評分達到最高值，與響應面理論值吻合性良好。

枯草芽孢桿菌，固態(tài)發(fā)酵，多肽，響應面分析

油菜籽是中國最主要的油料資源之一，近年來其產(chǎn)量在世界上名列前茅[1]。油菜籽榨油之后得到的副產(chǎn)物為菜籽粕，后者富含蛋白質(zhì)、礦質(zhì)元素和維生素，氨基酸組成較平衡，是一種營養(yǎng)價值很高的植物蛋白資源[2]。但菜籽粕含有硫苷、芥酸、單寧和植酸等抗營養(yǎng)因子，嚴重限制了它的應用范圍[3-5]。

菜籽肽是以菜籽粕或菜籽蛋白為原料通過降解而得到的一種低分子肽混合物，不但具有一定的營養(yǎng)功能，還具有多種生物活性，如抗氧化，降血壓等。目前，以菜籽粕或菜籽蛋白為原料制備菜籽肽的方法主要有酶水解法、微生物發(fā)酵法和化學水解法。微生物發(fā)酵法可以利用微生物產(chǎn)生的豐富的酶系，將菜籽粕中的大分子蛋白水解成菜籽肽的同時降解菜籽粕中的有毒物質(zhì)和抗營養(yǎng)因子[6-10]，因而備受關注。

固態(tài)發(fā)酵與其他培養(yǎng)方式相比具有培養(yǎng)基簡單且來源廣、技術較簡單、投資少、能源消耗低、后期處理較簡單、發(fā)酵過程粗放等優(yōu)點[11-13]。本實驗采用微生物固態(tài)發(fā)酵法同時生產(chǎn)菜籽肽并降解硫苷，采用響應面分析的方法及多指標實驗設計綜合加權評分法優(yōu)化菜籽粕固態(tài)發(fā)酵工藝，兼顧抗營養(yǎng)因子的脫除和多肽的得率，以獲得最優(yōu)的發(fā)酵工藝條件，降低生產(chǎn)成本，縮短發(fā)酵周期，提高菜籽粕品質(zhì)及綜合利用率，為菜籽粕的有效開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菜籽粕 w（粗蛋白）≥40.80%，w（水分）≤9.0%，硫苷≥46.51μmol/g，40目過篩，由丹陽市正大油脂有限公司提供；枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）W1-3 本實驗室從鎮(zhèn)江恒順醋醅分離得到，北京諾賽基因公司鑒定；Gly-Gly-Tyr-Arg 購于SIGMA公司；其他試劑 分析純；基礎種子培養(yǎng)基 含蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、牛肉浸膏0.3%、瓊脂2%，pH7.0；種子培養(yǎng)基 含蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、牛肉浸膏0.3%，pH為7.0；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 菜籽粕30g，水依據(jù)發(fā)酵實驗不同的設計要求加入。

BS124S型電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；YX280A型滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；PHS-25型數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器有限公司；UV-1601型紫外可見分光光度計 北京諾利分析儀器公司；LRH-250型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司；TGL-16型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；QYC-200型全溫空氣搖床 上海?，攲嶒炘O備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 基礎種子與種子液制備 將實驗室保存的菌種接種基礎培養(yǎng)基上，在30℃的生化培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h，讓菌種活化。挑取活化后的2環(huán)菌體接入100mL滅過菌的裝有種子培養(yǎng)基的錐形瓶中，8層紗布封口，放在空氣搖床中進行擴大培養(yǎng)，溫度為30℃，轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)24h。從上述培養(yǎng)好的菌液中按5%的接種量接種到50mL發(fā)酵種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12h，制成發(fā)酵種子液。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 吸取一定體積上述種子液，接種于裝有滅好菌的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，用無菌玻璃棒攪拌混勻，錐形瓶用8層紗布封口，一定溫度下恒溫發(fā)酵一定時間后，將樣品放入干燥箱中，50℃烘干后，粉碎過40目篩。

1.2.3 菜籽多肽得率的測定 參照文獻[14]。取5g粉碎后的固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)加入蒸餾水，定容到100mL，攪拌30min，5000r/min離心30min。取上述上清液2mL，加入10%的三氯乙酸水溶液2mL，混勻后靜置10min，再12000r/min離心15min。取2mL上述溶液于玻璃試管中，加入8mL雙縮脲試劑，混勻后靜置10min，4000r/min離心10min，于540nm下測定上清液OD值，對照標準曲線求得樣品多肽濃度，多肽得率按照以下公式計算：

式中：C為發(fā)酵液中多肽濃度，mg/mL；V為發(fā)酵液總體積，mL；M為菜籽粕質(zhì)量，mg。

1.2.4 硫苷含量的測定 參照文獻[15]。硫苷降解率按照以下公式計算：

硫苷降解率（%）=（原菜籽粕中硫苷含量-發(fā)酵菜籽粕中硫苷含量）/原菜籽粕中硫苷含量×100

1.3 實驗設計

1.3.1 單因素實驗設計 其他因素條件固定，依次分別以發(fā)酵時間（36、48、60、72、84、96h），液料比（0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1、1.2∶1、1.4∶1、1.6∶1mL/g）、接種量（5%、10%、15%、20%、25%）和發(fā)酵溫度（25、30、35、40℃）為單因素，考察各因素對多肽得率和硫苷降解率的影響，確定其最佳因素水平。選取前一個單因素的最優(yōu)水平進行后一個單因素實驗的研究，研究第一個單因素（發(fā)酵時間）時其他因素水平固定為：發(fā)酵溫度30℃、接種量10%、液料比1∶1。

1.3.2 響應面實驗設計 根據(jù)單因素實驗，選取對發(fā)酵影響較大的發(fā)酵時間（A）、液料比（B）和發(fā)酵溫度（C）三個單因素為研究因素，以多肽得率（Y1）、硫苷降解率（Y2）和兩者的綜合評分（OD）為評價指標，進行響應面優(yōu)化實驗的中心組合設計。因素及其水平如表1所示，-1、0、1分別代表各因素的低、中、高3個水平。

表1 Box-Behnken中心組合設計的因素和水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

1.4.1 數(shù)據(jù)進行方差分析的軟件為SPSS 16.0；響應面設計與分析的軟件為Design-Expert 8.0；實驗數(shù)據(jù)均為3次平行實驗的平均值。

1.4.2 綜合評分（overall desirability，OD） 在實際生產(chǎn)過程中，既需最大限度地對菜籽粕中的抗營養(yǎng)物質(zhì)進行降解，又要保證較高的多肽的得率，所以選取多肽得率和硫苷降解率一同作為評價指標進行綜合評分，并且將兩者權重系數(shù)均設為0.5，則：OD＝（D1× 0.5＋D2×0.5）。在計算綜合指標之前，采用極差化法將各指標進行規(guī)格化[16]。由于多肽得率和硫苷降解率均要求達到最大化，其規(guī)格化方程為：Di=（Yi-Ymin）/（Ymax-Ymin），其中，Ymax和Ymin分別為各指標的最大值與最小值，若某實驗的指標值為Ymax時，將Di設為1。反之，某個指標值為Ymin時，Di為0[17]。

圖1 發(fā)酵時間對多肽得率和硫苷降解率的影響Fig.1 Effect of fermentation time on peptide recovery ratio and glucosinolate degradation rate

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素發(fā)酵實驗

2.1.1 發(fā)酵時間對多肽得率和硫苷降解率的影響由圖1可以看出，發(fā)酵時間對多肽得率和硫苷降解率影響顯著。發(fā)酵時間為60h時，多肽得率達到最高值。這主要原因是：發(fā)酵前期，枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶將菜籽蛋白水解成菜籽肽，導致多肽含量增加；隨著發(fā)酵時間的增加，蛋白酶進一步水解部分菜籽蛋白和菜籽肽生成游離的氨基酸，因而多肽含量有所減少[7]。菜籽粕中硫苷降解率隨發(fā)酵時間延長而提高，在發(fā)酵72h后趨于平緩。綜上分析，最適合的發(fā)酵時間為60～72h。

2.1.2 液料比對多肽得率和硫苷降解率的影響 由圖2可以看出，隨著液料比的增加，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者分別在1.2∶1和1.4∶1處達到最大值。水分過低會影響菜籽粕中營養(yǎng)物質(zhì)的溶解性，影響菌體的生長和代謝；而水分過高，物料粘連，會降低菜籽粕的通透性，影響氣體的傳遞及物料熱量的散發(fā)，導致菌體氧氣的利用下降，不利于發(fā)酵。因而水分過低或者過高都會導致多肽得率和硫苷降解率降低。綜上分析，最適合的液料比為1.2∶1～1.4∶1。

圖2 液料比對多肽得率和硫苷降解率的影響Fig.2 Effect of liquid/material ratio on peptide recovery ratioand glucosinolate degradation rate

2.1.3 接種量對多肽得率和硫苷降解率的影響 由圖3可以看出，隨著接種量的增加，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者在接種量為15%時均達到最大值。但是接種量對兩者的影響并不是很顯著，考慮到生產(chǎn)成本，固定接種量為15%。

圖3 接種量對多肽得率和硫苷降解率的影響Fig.3 Effect of liquid/material ratio on peptide recovery ratio and glucosinolate degradation rate

2.1.4 發(fā)酵溫度對多肽得率和硫苷降解率的影響發(fā)酵溫度較低時，微生物的代謝活動較弱，產(chǎn)酶量相對較少；而發(fā)酵溫度過高對微生物的生長及代謝活動有負面影響，也不利于其產(chǎn)酶。在適宜的溫度下，微生物生長代謝活躍，產(chǎn)酶量高，有利于多肽的產(chǎn)生和硫苷的降解。由圖4可以看出，隨著發(fā)酵溫度的提高，多肽得率和硫苷降解率都是先提高后降低，兩者分別在30℃和35℃處達到最大值。綜上分析，最適合的發(fā)酵溫度為30～35℃。

圖4 發(fā)酵溫度對多肽得率和硫苷降解率的影響Fig.4 Effect of fermentation temperature on peptide recovery ratio and glucosinolate degradation rate

2.2 響應面分析法優(yōu)化發(fā)酵條件結(jié)果分析

2.2.1 響應面優(yōu)化方差分析 根據(jù)Box-Behnken中心組合設計了17組實驗（含5組中心點重復）。實驗設計及結(jié)果見表2。

采用Design-Expert.8.0軟件對表2的數(shù)據(jù)進行二次多項式回歸擬合，得到多肽得率、硫苷降解率和綜合評分的二次回歸方程分別為：

Y1=-96.866+0.581A+20.556B+5.142C+0.001AB-0.010AC-0.151BC-0.002A2-6.008B2-0.069C2（R2= 0.9818，R2Adj=0.9584）；

Y2=-376.86235+1.45039A+159.27832B+17.60280C-0.40526AB-0.011094AC-1.09350BC-0.00335A2-37.29495B2-0.24092C2（R2=0.9817，R2Adj=0.9582）；

YOD=-15.605+0.071A+4.522B+0.714C-7.434AB-0.001AC-0.032BC-0.0002A2-1.150B2-0.010C2（R2= 0.9928，R2Adj=0.9836）。

多肽得率、硫苷降解率和綜合評分回歸方程的回歸分析與方差分析結(jié)果分別如表3～表5所示。由表3可知，多肽得率模型的F值為42.01大于F0.01（9，4），說明該模型回歸顯著可靠。其R2=0.9818，R2Adj=0.9584，說明建立的模型和實驗擬合良好，因而能用于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)多肽的分析和預測。依F檢驗知，各因素對多肽得率的影響由大到小依次為：發(fā)酵溫度（C）、液料比（B）、發(fā)酵時間（A），因素A、B、C、AC、A2、B2和C2的p值均小于0.01，說明其對多肽得率影響極顯著，且各實驗因素對多肽得率的影響不是簡單的線性關系，發(fā)酵時間與溫度兩者有交互作用，如圖5所示。

由表4可知，硫苷降解率模型的F值為41.73大于F0.01（9，4），說明該模型回歸顯著可靠。其R2=0.9817，R2Adj=0.9582，說明建立的模型和實驗擬合良好，因而能用于固態(tài)發(fā)酵降解硫苷的分析和預測。依F檢驗知，因素A、B和C的p值均小于0.01，說明其對硫苷降解率影響極顯著；AB、BC、B2、C2的p值均小于0.05，說明B2、C2對硫苷降解率影響顯著，且各實驗因素對硫苷降解率的影響不是簡單的線性關系，發(fā)酵時間和液料比、液料比和發(fā)酵溫度均有交互作用，如圖6所示。

表2 Box-Behnken中心組合的實驗設計與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of Box-Behnken central composite

表3 多肽得率方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results of peptide recovery ratio

圖5 影響多肽得率的因素之間的交互作用Fig.5 The interaction between factors that affect peptide recovery ratio

表4 硫苷降解率方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of glucosinolate degradation rate

由表5可知，綜合評價指標模型的F值為107.41大于F0.01（9，4），說明該模型回歸顯著可靠。其模型R2=0.9928，R2Adj=0.9836，說明建立的模型和實驗擬合良好，能用于該反應的理論預測。依F檢驗知，所有因素的p值均小于0.01，說明其對發(fā)酵綜合評價指標影響極顯著，且各實驗因素對綜合評分的影響不是簡單的線性關系，發(fā)酵時間、液料比和發(fā)酵溫度兩兩之間均有交互作用，如圖7所示。

表5 綜合評分方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of overall desirability

圖6 影響硫苷降解率的因素之間的交互作用Fig.6 The interaction between factors that affect glucosinolate degradation rate

2.2.2 響應面最優(yōu)條件優(yōu)化、預測和驗證 由表6可知，若以多肽得率和硫苷降解率兩者作為評價指標，所得的最優(yōu)發(fā)酵條件是不一致的，因而選用兩者的綜合評價指標進行綜合考慮。最終得出最優(yōu)的發(fā)酵條件為發(fā)酵時間為69.75h，液料比為1.31∶1mL/g，發(fā)酵溫度為31.36℃，此時所對應的多肽得率、硫苷降解率理論值分別為15.95%、61.53%。為方便各實驗條件的控制，最優(yōu)的發(fā)酵條件修正為：發(fā)酵時間為70h，液料比1.3∶1mL/g，發(fā)酵溫度為31℃。

圖7 影響綜合評分的因素之間的交互作用Fig.7 The interaction between factors that affect overall desirability

表6 多肽得率、硫苷降解率和綜合評分的最佳水平表Table 6 Optimal level of peptide recovery ratio，glucosinolate degradation rate and overall desirability

表7 最優(yōu)發(fā)酵條件驗證實驗結(jié)果Table 7 Validate experiment result of optimum fermentation conditions

為了驗證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，在修正后的最優(yōu)發(fā)酵條件下進行3次平行實驗，結(jié)果由表7所示。理論預測值與驗證實驗的平均值相接近，說明該模型可以較好地預測菜籽多肽得率和硫苷的降解率。

3 結(jié)論

通過單因素實驗和響應面分析，采用多指標綜合評分法研究多肽得率和硫苷降解率對發(fā)酵后菜籽粕品質(zhì)的影響，得到最優(yōu)的發(fā)酵工藝為：發(fā)酵時間為70h，液料比為1.3∶1，發(fā)酵溫度為31℃，此時多肽得率、硫苷降解率理論值分別為15.95%、61.53%，兩者的綜合評分達到最高值。驗證實驗結(jié)果分別為15.94%、62.14%，與理論值吻合性良好。

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Study on solid-state fermentation of rapeseed meal for preparation of peptides and degradation of glucosinolates by Bacillus subtilis

HE Rong-hai，JIANG Bian，ZHU Pei-pei，DING Wen-hui，MA Hai-le
（School of Food and Bioengineering，Jiangsu University，Jiangsu Key Laboratory of Agricultural Product Physical Processing，Zhenjiang 212013，China）

With rapeseed meals as raw material，together with peptide recovery ratio and glucosinolate degradation rate as main quality evaluation indexes in this solid-state fermentation，then based on single factor experiment and the Box-Behnken response surface analysis，the craft that rapeseed peptide was produced with Bacillus subtilis.The results showed that the best fermentation conditions were as follows：fermentation time 70h，ratio of water to material 1.3∶1mL/g，fermentation temperature 31℃.Under these conditions，the rapeseed peptide recovery ratio and glucosinolate degradation rate were 15.94%and 62.14%respectively.Their overall desirability was maximum.The experimental vaule was basically agreed with the theoretical value of response surface analysis.

Bacillus subtilis；solid-state fermentation；polypeptides；response surface analysis

TS201.1

A

1002-0306（2014）10-0228-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.043

2013－08－27

何榮海（1971-），男，博士、副教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工技術方面的研究。

國家十二五科技支撐計劃（2013BAD10B03）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技支撐計劃（BE2011401）；江蘇省自然科學基金項目（BK2012708）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目。