遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563003

負(fù)載核糖體蛋白L8的樹突狀細(xì)胞對(duì)黑色素瘤的抑制作用

李燕 尹令絲 岳歡 黃俊瓊 胡永林

遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴州 遵義563003

背景與目的：研究發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白L8(ribosomal protein L8，RPL8)在黑色素瘤中表達(dá)能激活黑色素瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并產(chǎn)生白細(xì)胞介素2，提示RPL8可能參與抗腫瘤免疫應(yīng)答，有望成為抗腫瘤治療的靶點(diǎn)。本研究通過(guò)RPL8蛋白負(fù)載樹突狀細(xì)胞(dentritic cell，DC)，探討負(fù)載RPL8蛋白的DC對(duì)黑色素瘤的免疫效應(yīng)。方法：原核表達(dá)RPL8蛋白，純化后致敏小鼠骨髓來(lái)源DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志，MTT法檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞的殺傷作用；負(fù)載RPL8蛋白DC免疫治療小鼠后，觀察腫瘤體積變化及小鼠生存時(shí)間。結(jié)果：純化蛋白經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析見約28×103大小的特異性條帶；DC經(jīng)RPL8及細(xì)菌脂多糖(Lipoplysaccharide，LPS)誘導(dǎo)成熟后細(xì)胞表面CD11c、CD80、MHC-Ⅰ類、MHC-Ⅱ類分子表達(dá)增高，能激活T淋巴細(xì)胞，對(duì)B16細(xì)胞有抑制作用，RPL8-DC組的抑制率在效靶比為30∶1時(shí)高達(dá)70%，較PBS組和DC組明顯增高；負(fù)載RPL8蛋白DC免疫治療小鼠后，腫瘤體積縮小，小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)。結(jié)論：負(fù)載RPL8的DC對(duì)黑色素瘤有生長(zhǎng)抑制作用。

核糖體蛋白L8；樹突狀細(xì)胞；黑色素瘤；免疫治療

樹突狀細(xì)胞是目前已知的抗原提呈功能最強(qiáng)的細(xì)胞，有強(qiáng)大的激活CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)及CD4+輔助T細(xì)胞的能力。樹突狀細(xì)胞(dentritic cell，DC)表面高表達(dá)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類及黏附分子，在激發(fā)免疫反應(yīng)誘導(dǎo)CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷的過(guò)程中起重要作用。以腫瘤特異性抗原或腫瘤相關(guān)抗原致敏DC，可誘導(dǎo)特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答［1-2］。本研究采用原核表達(dá)的核糖體蛋白L8(ribosomal protein L8，RPL8)沖擊DC，探討RPL8致敏的DC對(duì)黑色素瘤的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

E.coliDH5a、BL21、PET28a(+)質(zhì)粒、PUC57-RPL8由本實(shí)驗(yàn)室保存；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcolⅠ購(gòu)自日本Takara公司；質(zhì)粒中小量提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Omega公司；6～8周齡C57BL/6小鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；重組小鼠GM-CSF、IL-4分別購(gòu)自杭州隆基生物科技公司、PeproTech公司；熒光素標(biāo)記的anti-CD11c、anti-CD80、anti-MHC-Ⅰ、anti-MHC-Ⅱ購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。

1.2 方法

1.2.1 RPL8原核表達(dá)載體的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)

以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pUC57-RPL8載體為模板，擴(kuò)增目的基因RPL8，構(gòu)建pET28a(+)-RPL8原核表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后將其轉(zhuǎn)化BL21工程菌，用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，采用Ni柱進(jìn)行純化，純化蛋白用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)進(jìn)行鑒定。

1.2.2 負(fù)載RPL8蛋白的DC的制備及鑒定

無(wú)菌取小鼠股骨、脛骨，PBS液沖洗髓腔，收集沖洗液，NH4Cl溶液裂解紅細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)(含10 ng/mL的GM-CSF和5 ng/mL的IL-4)，第6天加入RPL8蛋白，使其終濃度為10 μg/mL，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)，第2天加入LPS繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，即為RPL8-DC。加入RPL8一抗和二抗，熒光顯微鏡下觀察。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD80、CD11c、MHC-Ⅰ及MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞殺傷活性測(cè)定

取小鼠脾臟，研磨成勻漿，低滲破紅細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸制成細(xì)胞懸液后，加至尼龍毛柱中，與37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下培養(yǎng)1 h，收集T細(xì)胞。分別取PBS、DC、RPL8-DC與T細(xì)胞以1∶3比例混勻，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106/mL，培養(yǎng)24 h后以效靶比為10∶1、20∶1、30∶1加入培養(yǎng)于96孔板內(nèi)的B16細(xì)胞中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入MTT，4 h后加入DMSO，于570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組的A值。

1.2.4 體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)

小鼠右前腋下注射B16細(xì)胞(1×106/只)，待小鼠長(zhǎng)出腫瘤后即為荷瘤小鼠模型。荷瘤5 d后，隨機(jī)將荷瘤小鼠分為3組，分別接受PBS、DC、RPL8-DC注射，體積為200 μL，每隔5 d注射1次，共3次，用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠的腫瘤大小，觀察小鼠的生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 純化蛋白的鑒定

重組蛋白經(jīng)Western blot分析，可見大小約28×103的特異性條帶，同時(shí)以BL21空菌作為對(duì)照，對(duì)照菌未出現(xiàn)相應(yīng)條帶(圖1)。

圖1 純化蛋白的鑒定Fig. 1 Puri fi ed protein was identi fi ed by Western blot

2.2 DC表面標(biāo)志分析

在體外培養(yǎng)第6天未經(jīng)RPL8誘導(dǎo)的DC，細(xì)胞表面特征性分子CD11c，共刺激分子CD80，MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子低表達(dá)；經(jīng)RPL8、 LPS誘導(dǎo)后的DC表面標(biāo)志符合成熟DC的特點(diǎn)，即CD11c、CD80、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ類分子等高表達(dá)(圖2)。

圖2 DC細(xì)胞表型鑒定Fig. 2 The membrane molecules on DC were analyzed after stimulation with RPL8

2.3 RPL8-DC的鑒定

DC和RPL8蛋白混合培養(yǎng)24 h后加入RPL8一抗，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的條件下溫育1 h，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫避光1 h后，熒光顯微鏡下觀察可見細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光(圖3)。

2.4 RPL8-DC誘導(dǎo)T細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

RPL8-DC激活的T淋巴細(xì)胞對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞的抑制率，以效靶比30∶1的效率最高，為70%，DC組的抑制率為48%，PBS組的抑制率為35%，RPL8-DC組對(duì)黑色素瘤的抑制率較DC組及PBS組明顯增高(P＜0.05，圖4)。

2.5 荷瘤小鼠的生存時(shí)間及腫瘤體積的變化

C57BL/6小鼠右前腋皮下接種B16細(xì)胞5 d后，所有小鼠接種部位均出現(xiàn)直徑約0.2～0.3 cm大小的結(jié)節(jié)，此時(shí)給予第1次免疫治療，隔5 d免疫1次 ，游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小，直到PBS組和DC組出現(xiàn)進(jìn)食減少、精神萎靡、活動(dòng)減少，逐漸死亡。RPL8-DC組的腫瘤大小顯著小于PBS組及DC組(P＜0.05)，PBS組與DC組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5)。RPL8-DC組小鼠的生存期明顯延長(zhǎng)，RPL8-DC組與DC組、PBS組比較，小鼠的生存期差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖6)。

圖4 各組對(duì)B16細(xì)胞的殺傷效應(yīng)Fig. 4 RPL8-DC inhibited the growth of B16 cells

圖5 RPL8-DC治療后腫瘤體積的變化Fig. 5 The tumor volumes after treatment with RPL8-DC

圖6 RPL8-DC治療后荷瘤小鼠的生存時(shí)間Fig. 6 Survival period of tumor-bearing mice after treatment with RPL8-DC

3 討 論

黑色素瘤是來(lái)源于黑色素細(xì)胞的腫瘤，常發(fā)生于皮膚，惡性程度高，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，近年來(lái)其發(fā)生率和死亡率呈上升趨勢(shì)。黑色素瘤早期以手術(shù)切除為主要治療手段，結(jié)合化療、放療效果仍不理想，復(fù)發(fā)率高，5年生存率低于10%，屬于難治療的腫瘤之一，需要新的治療手段的開發(fā)和應(yīng)用［3］。腫瘤發(fā)生過(guò)程中常常伴有機(jī)體抗腫瘤免疫功能的低下，發(fā)生機(jī)制包括腫瘤抗原調(diào)變、表達(dá)減少，以及抗原提呈細(xì)胞MHC及共刺激分子的下調(diào)等，導(dǎo)致不能有效提呈抗原、刺激產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答［4］。腫瘤疫苗研究主要是圍繞如何增強(qiáng)腫瘤的免疫原性、增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答及如何打破腫瘤免疫耐受這一關(guān)鍵問(wèn)題。理想的腫瘤疫苗不僅能刺激宿主產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，而且還應(yīng)安全、無(wú)不良反應(yīng)，具有預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)的保護(hù)性的長(zhǎng)期的免疫記憶功能［5］。

樹突狀細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)，是唯一能直接激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞，在抗腫瘤免疫應(yīng)答的啟動(dòng)及調(diào)控中起著極其關(guān)鍵的作用［6-7］。近年來(lái)，利用DC提呈腫瘤抗原，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫是腫瘤免疫治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Lin等［8］將腫瘤抗原基因MAGE-A3轉(zhuǎn)染DC，后者可誘導(dǎo)抗原特異的T細(xì)胞應(yīng)答，活化的T細(xì)胞可抑制腫瘤細(xì)胞系Huah-7、SGC-7901的生長(zhǎng)。Markowicz等［9］給黑色素瘤Ⅲ期患者用負(fù)載黑色素瘤抗原肽的DC疫苗進(jìn)行治療可使患者3年生存率明顯提高。目前抗原致敏的DC疫苗已應(yīng)用于腫瘤的輔助治療，但其誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)的能力還不穩(wěn)定，究其根本原因在于抗原的免疫原性，與抗原的選擇有關(guān)。RPL8屬于核糖體蛋白家族，參與蛋白質(zhì)翻譯、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控等。研究發(fā)現(xiàn)RPL8在腦膠質(zhì)瘤、黑色素瘤和乳腺癌中高表達(dá)，能被CD4+HLA-DR7限制性的Th細(xì)胞識(shí)別，能激活黑色素瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞增殖并產(chǎn)生白細(xì)胞介素2，提示RPL8可作為腫瘤抗原，用于腫瘤的免疫治療［10］。

本實(shí)驗(yàn)利用原核表達(dá)技術(shù)表達(dá)目的蛋白R(shí)PL8，RPL8沖擊致敏DC，獲得的負(fù)載RPL8的DC免疫治療小鼠后，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，RPL8-DC組腫瘤體積較PBS組和DC組明顯縮小。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RPL8沖擊后的DC能激活T細(xì)胞，抑制B16黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，與PBS組和DC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明所制備負(fù)載RPL8的DC具有誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗腫瘤免疫的能力。負(fù)載RPL8的DC能明顯抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，PBS組、DC組的小鼠在24 d內(nèi)均死亡，而負(fù)載RPL8的DC組生存期為31 d，荷瘤小鼠的腫瘤體積變化及生存期與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究成功制備了負(fù)載RPL8的DC，在體內(nèi)外可抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Experimental study of the anti-melanoma effect of dentritic cells pulsed with RPL8 peptide

LI Yan,YIN Ling-si,YUE Huan,HUANG Jun-qiong,HU Yong-lin (Clinical Laboratory, A fi liated Hospital of Zunyi Medical College, Zunyi Guizhou 563003, China)

HUANG Jun-qiong E-mail: junqiongh@aliyun.com

Background and purpose:Studies have shown that ribosomal protein L8 (RPL8) is shared by melanomas, gliomas and ovarian carcinomas. A peptide of RPL8 signi fi cantly stimulated proliferation and cytokine expression of the hepler T cell clone and lymphocytes in melanoma patients. RPL8 may stimulate anti-tumor immunity, making RPL8 an attractive candidate for therapeutic intervention. In this study, we prepared DC pulsed by RPL8 (RPL8-DC) and investigate the anti-tumor effect of RPL8-DC on melanoma in mice.Methods:The recombinant protein was achieved through IPTG induction in E. coli and identi fi ed with Western blot. Bone marrow-derived DC was loaded with RPL8 protein. RPL8 and CD11c, CD80, MHC-Ⅰ, MHC-Ⅱ molecules on dentritic cells were monitored by fl uorescence microscope and FACS analysis, respectively. The anti-tumor effect of T cells in vitro was detected by MTT assay. Subcutaneous tumors were induced in C57BL/6 mice using B16 cells. The tumor volumes were measured after injection with RPL8-DC.Results:The puri fi ed protein was combined with speci fi c antibodies. DCs pulsed by RPL8 were visualized under fl uorescent microscopy. CD11c, CD80, MHC-Ⅰ, MHC-Ⅱ molecules on DCs were up-regulated after stimulation with RPL8 and LPS. B16 cells were inhibited by T cells stimulated with RPL8-DC. The inhibition rate of tumor cells was 70% in RPL8-DC group when effector-to-target ratio was 30∶1, which was higher than PBS and DC groups. Inhibition of growth could be observed more signi fi cantly in mice after the treatment with RPL8-DC. The mice receiving the therapy of RPL8-DC were able to survive much longer than the mice receiving control therapy.Conclusion:The DC pulsed by RPL8 protein can inhibit the growth of melanoma.

Ribosomal protein L8; Dendritic cells; Melanoma; Immunotherapy

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.007

R739.5；R73-3

A

1007-3639(2014)04-0279-05

2014-01-26

2014-03-26）

貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(No：黔科合丁字20082198)；貴州省衛(wèi)生廳科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目(No：gzwkj2012-1-063)。

黃俊瓊 E-mail:junqiongh@aliyun.com