趙芝梅 朱宇 吳燕 樊春筍 陳陶陽 甘愉 屠紅

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032；2.啟東肝癌防治研究所，啟東腫瘤醫(yī)院病因室，江蘇 啟東 226200

反向雜交檢測肝癌相關(guān)乙型肝炎病毒前C區(qū)突變方法的建立和應(yīng)用

趙芝梅1 朱宇1 吳燕1 樊春筍1 陳陶陽2 甘愉1 屠紅1

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所癌基因及相關(guān)基因國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200032；2.啟東肝癌防治研究所，啟東腫瘤醫(yī)院病因室，江蘇 啟東 226200

背景與目的：日益增多的研究表明，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)DNA前C區(qū)G1896A和G1899A突變是肝癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。本研究旨在建立簡單、快速、靈敏和準(zhǔn)確的檢測HBV前C區(qū)突變的反向雜交方法，并應(yīng)用于檢測江蘇省啟東地區(qū)HBV DNA前C區(qū)突變與肝癌發(fā)生的關(guān)系。方法：設(shè)計(jì)并合成HBV DNA前C區(qū)1896和1899位點(diǎn)的特異性探針，通過優(yōu)化條件建立特異、敏感的雜交體系，并與直接測序檢測結(jié)果進(jìn)行比較。將該方法應(yīng)用于檢測啟東100例肝癌和100例慢性HBV攜帶者(對照組)，分析HBV DNA前C區(qū)突變與肝癌的關(guān)系。結(jié)果：反向雜交對血清樣本的最低檢測下限為HBV DNA 103copy/mL，檢測混合感染時(shí)比直接測序更占優(yōu)勢，混合株中10%以上的突變株均可被檢測。啟東地區(qū)HBV DNA前C區(qū)G1899A突變與肝癌高發(fā)具有相關(guān)性(P=0.000, OR=4.846, 95%CI：2.240～10.485)，而G1896A突變未見其相關(guān)性。結(jié)論：反向雜交檢測HBV DNA前C區(qū)突變方便、快速、準(zhǔn)確，可有效監(jiān)控肝癌的發(fā)生，適合臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。

乙型肝炎病毒；前C區(qū)；反向雜交；突變；肝癌

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)慢性感染是導(dǎo)致我國肝癌發(fā)生的重要原因［1］。HBV DNA有4個(gè)開放讀碼區(qū)(open reading frame，ORF)：前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、X區(qū)和P區(qū)。目前已有多項(xiàng)研究證實(shí)，HBV DNA前C區(qū)G1896A和G1899A突變均能增加肝癌發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)［2-7］。薈萃分析顯示，HBV DNA前C區(qū)G1896A和G1899A突變導(dǎo)致肝癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)分別提高1.46和3.13倍［8］。因此建立—種簡單、靈敏、準(zhǔn)確的HBV前C區(qū)突變檢測方法具有重大意義。目前已有各種HBV DNA前C區(qū)突變的檢測方法，如聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)產(chǎn)物直接測序［2-7］、限制性片段長度多態(tài)性分析［9］、熒光定量PCR［10-11］和基因芯片［12］等，其中DNA測序是序列分析的金標(biāo)準(zhǔn)，但對混合感染的檢出率低。反向雜交技術(shù)是一種建立于PCR基礎(chǔ)上的方法，已應(yīng)用于結(jié)核桿菌和地中海貧血致病基因的檢測等［13-14］。本研究通過建立檢測HBV DNA前C區(qū)G1896A和G1899A突變的反向雜交技術(shù)，為肝癌預(yù)警提供適合大規(guī)模臨床推廣的突變檢測方法。

1 資料和方法

1.1 研究對象

性別和年齡相匹配的100例肝癌和100例慢性HBV攜帶者(慢性肝炎，對照組)均為2007年10月—2012年10月期間江蘇省啟東市人民醫(yī)院收治的臨床患者。所有患者血清均置于-70 ℃冰箱凍存。肝癌的診斷符合2001年中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會修訂的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》［15］?；颊呔炇鹬橥鈺?，本研究獲得啟東人民醫(yī)院及上海市腫瘤研究所倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 HBV標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)測序結(jié)果為G1896/G1899、1896A、1899A和1896A/1899A的患者血清樣本用Q5TM超保真DNA聚合酶(New England Biolabs公司)分別進(jìn)行HBV DNA前C區(qū)PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物克隆在平端載體pEASY-Blunt Zero(北京TransGens公司)上，并通過質(zhì)粒抽提(美國Omega公司)，測序篩選，構(gòu)建HBV野生型和3種突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.2.2 引物和探針

通過對比GenBank數(shù)據(jù)庫中所有人HBV全基因組序列，選擇保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和擴(kuò)增質(zhì)控探針，上游引物5’端生物素標(biāo)記。根據(jù)檢測位點(diǎn)特異性設(shè)計(jì)探針： 1896和1899位點(diǎn)的野生型探針(G1896/G1899)、1896位點(diǎn)的突變型探針(1896A)、1899位點(diǎn)的突變型探針(1899A)、1896和1899位點(diǎn)的突變型探針(1896A/1899A)、擴(kuò)增質(zhì)控探針(amplification control)和顯色質(zhì)控探針(conjugate control)。擴(kuò)增質(zhì)控探針為HBV基因組一段保守序列，能與任何PCR陽性產(chǎn)物結(jié)合，若該探針未顯色，則說明HBV DNA陰性或者HBV DNA含量低于本方法的檢測下限。顯色質(zhì)控探針3’端生物素標(biāo)記，不與目的產(chǎn)物結(jié)合，只與顯色試劑結(jié)合，質(zhì)控顯色過程。引物與探針序列見表1，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 HBV DNA提取及前C/C基因DNA擴(kuò)增

取患者血清100 μL按QIAamp MinElute virus Spin試劑盒(德國Qiagen公司)說明書的方法進(jìn)行血清HBV DNA抽提，產(chǎn)物溶解于30 μL無菌水中。第一輪引物為Pre-CF1和HBV2433R，第二輪引物為Pre-CF1和Pre-CR2，引物序列見表1。以PrimeSTAR Max(日本Takara公司)系統(tǒng)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延鏈7 min。第1輪PCR結(jié)束后，取1 μL產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二輪PCR。獲得目的產(chǎn)物后，直接用于反向雜交或4 ℃儲存。

表1 引物與探針列表Tab. 1 The list of primers and probes used in the study

1.2.4 反向雜交檢測HBV DNA前C區(qū)突變

①雜交膜的制備：將探針配制成10 pmol/ μL，每條探針各取1 μL按G1896/G1899、1896A、1899A、1896A/1899A、擴(kuò)增質(zhì)控和顯色質(zhì)控探針順序固定于尼龍膜上。②反向雜交條件的優(yōu)化：雜交與洗膜是雜交體系的關(guān)鍵步驟。用HBV野生型和突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒依次對雜交液濃度、洗膜液濃度、洗膜時(shí)間和雜交溫度進(jìn)行優(yōu)化。③顯色：按照Biotin Chromogenic檢驗(yàn)試劑盒(美國Thermo Scientific公司)的說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 直接測序及平端克隆

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒(美國Axygen公司)純化后送上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行直接測序。對于反向雜交檢測結(jié)果與直接測序結(jié)果不一致的樣本，進(jìn)行平端載體克隆(方法同1.2.1)，每份樣本挑選10個(gè)克隆進(jìn)行測序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分類變量采用χ2檢驗(yàn)或確切概率法檢驗(yàn)，并比較顯著性差異，計(jì)算OR值。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 反向雜交檢測探針的設(shè)計(jì)

由于膜上所有的探針與PCR擴(kuò)增片段均須在同一條件下(溫度、離子強(qiáng)度和pH值)進(jìn)行分子雜交和洗膜，故首先要求各種探針具有盡可能接近的退火溫度。經(jīng)過探針的優(yōu)化，總結(jié)出探針的主要設(shè)計(jì)原則：①長度在17～26 bp；②退火溫度在50～56 ℃；③待檢測的突變位點(diǎn)盡量靠近序列的中間位置。具體序列見表1。

2.2 反向雜交檢測HBV DNA前C區(qū)突變方法的建立及特異性檢測

首先根據(jù)之前文獻(xiàn)報(bào)道的條件進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)［16］：20 μL變性的野生型和3種突變型質(zhì)粒PCR產(chǎn)物分別加入反應(yīng)管中，用雜交液(6×SSC和0.1%SDS)于44 ℃雜交45 min，洗膜液(0.7×SSC和0.1%SDS)洗5 min，顯色10～30 min。結(jié)果顯示信號強(qiáng)度較好，但非特異性信號明顯(圖1A)。產(chǎn)生非特異性信號最常見的2個(gè)原因：雜交過強(qiáng)和洗脫不完全。因此我們首先優(yōu)化雜交液濃度(6×SSC和0.1%SDS、4×SSC和0.1% SDS、2×SSC和0.1%SDS)，其他條件不變。當(dāng)雜交液濃度選用4×SSC和0.1%SDS，信號強(qiáng)度與特異性相對較好(圖1A)。然后選用0.7×SSC和0.1%SDS、0.5×SSC和0.1%SDS、0.3×SSC和0.1%SDS共3種濃度依次降低的洗膜液洗膜，當(dāng)選用0.5×SSC和0.1%SDS時(shí)，信號強(qiáng)度與特異性相對較好(圖1B)。最后選用5、10和15 min這3種洗膜時(shí)間，可見在10 min的洗膜時(shí)間信號強(qiáng)度與特異性最好，無非特異性信號(圖1C)。以此雜交條件為基礎(chǔ)，縮小或增大雜交溫度，雜交信號無明顯改變，44 ℃仍然是理想的雜交溫度(圖1D)。

2.3 反向雜交檢測的靈敏度

選用HBV DNA前C區(qū)1899位點(diǎn)進(jìn)行靈敏度的檢測，將G1896/G1899、1899A、擴(kuò)增質(zhì)控和顯色質(zhì)控探針置于膜上。半巢式PCR擴(kuò)增102～106copy/mL的野生型和1899位點(diǎn)突變型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，各取20 μL變性的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行反向雜交，可見該方法的最低檢測下限為HBV DNA 103copy/mL(圖2A和B)。

根據(jù)臨床血清樣本拷貝數(shù)檢測，拷貝數(shù)大多數(shù)在104～105copy/mL，因此本研究選用104copy/mL野生型和突變型質(zhì)粒，用反向雜交方法檢測按100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、60∶40、20∶80和0∶100比例進(jìn)行混合的野生型和1899位點(diǎn)突變型質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。結(jié)果顯示，突變株占混合株比例10%以上的均可被該方法檢出(圖2C)。此外，我們也對1896位點(diǎn)進(jìn)行同樣的靈敏度檢測，發(fā)現(xiàn)結(jié)果與1899位點(diǎn)一致。

2.4 反向雜交與直接測序檢測臨床樣本的結(jié)果比較

反向雜交檢測50例肝癌血清樣本HBV DNA前C區(qū)1896和1899位點(diǎn)的突變情況，并與直接測序結(jié)果比較(表2)，2種方法符合率達(dá)98%，僅1例樣品結(jié)果不一致，反向雜交檢測為混合感染，而直接測序檢測為野生型。將該例血清樣品PCR擴(kuò)增出HBV DNA前C區(qū)片段，并將PCR產(chǎn)物連接到平端載體克隆后，進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示該樣品為混合感染株，與反向雜交檢測結(jié)果一致。說明在檢測混合感染方面，反向雜交更加準(zhǔn)確。

圖1 反向雜交方法的建立及特異性檢測Fig. 1 Establishment and speci fi city detection of reverse hybridization to detect the HBV precore mutation

圖2 反向雜交檢測靈敏度Fig. 2 Determination of the sensitivity of the reverse hybridization

2.5 分析啟東地區(qū)HBV DNA前C區(qū)突變與肝癌的關(guān)系

本研究繼續(xù)用反向雜交方法檢測啟東地區(qū)50例肝癌和100例慢性肝炎患者的HBV前C區(qū)突變情況，并分析啟東地區(qū)HBV DNA前C區(qū)G1896A和G1899A突變與肝癌的關(guān)系。結(jié)果顯示：G1896A突變在肝癌組的發(fā)生率為48% (48/100)，在慢性肝炎組的發(fā)生率為35%(35/100)，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062，OR=1.714，95%CI：0.971～3.026)。G1899A突變在肝癌組的發(fā)生率為35%(35/100)，在慢性肝炎組的發(fā)生率為10%(10/100)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，OR=4.846，95%CI：2.240～10.485，表3)。

表2 反向雜交與直接測序檢測臨床樣本HBV DNA前C區(qū)突變的結(jié)果比較Tab.2 Comparison between direct sequencing and reverse hybridization results for the detection of HBV DNA precore mutation(n)

表3 分析江蘇省啟東地區(qū)HBV DNA前C區(qū)突變與肝癌的關(guān)系Tab. 3 Analysis of precore mutation in HCC and non-HCC patients from Qidong, Jiangsu Province

3 討 論

肝癌是一種高度惡性的腫瘤，HBV感染是導(dǎo)致肝癌的重要原因［17］。日益增多的研究表明，HBV前C區(qū)突變是肝癌的危險(xiǎn)因素，但由于方法學(xué)的缺陷限制了其在大規(guī)模危險(xiǎn)人群的篩檢［2-7］。目前已有的HBV前C區(qū)突變檢測方法中，直接測序是檢測前C區(qū)突變最常用的方法［2-7］，可觀察到HBV的已知和未知突變，但＜20%的突變株容易被忽略?？寺〖夹g(shù)雖然能彌補(bǔ)上述不足，但需要分析大量的克隆株。限制性片段長度多態(tài)性分析是使用核酸內(nèi)切酶對擴(kuò)增后的靶序列進(jìn)行特異性位點(diǎn)的切割，再經(jīng)過電泳判斷結(jié)果。由于HBV基因組分子進(jìn)化速度較快、變異頻繁，因此結(jié)果分析準(zhǔn)確率較低。實(shí)時(shí)熒光PCR不能同時(shí)檢測多位點(diǎn)突變，其應(yīng)用也受到限制。近年來，基因芯片技術(shù)已成功應(yīng)用于核酸分析，對檢測HBV基因組多態(tài)性具有很大的優(yōu)勢，但因其檢測費(fèi)用昂貴而限制了該技術(shù)在臨床實(shí)驗(yàn)室的推廣和應(yīng)用。相比上述這些方法，反向雜交法具有以下幾項(xiàng)優(yōu)點(diǎn)：①探針固定于膜上，干燥后儲存于4 ℃?zhèn)溆?，保存期?2個(gè)月內(nèi)一般不影響雜交結(jié)果。此膜可大量預(yù)先制備，檢測時(shí)，只需加入PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，然后加酶顯色即可。這樣可節(jié)省制備膜的時(shí)間，減少操作步驟。②操作簡單快速，無需特殊設(shè)備，從血清DNA抽提到樣本檢測完畢只需花費(fèi)6.5 h，便于現(xiàn)場大規(guī)模人群的篩查及臨床推廣應(yīng)用。③靈敏性高，可檢測混合感染中10%以上的突變株。④高通量，可實(shí)現(xiàn)同張膜多個(gè)突變位點(diǎn)的檢測，便于在臨床中推廣應(yīng)用［18］。因此本研究建立了一種簡單、快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法，該方法為肝癌預(yù)警提供了有效的監(jiān)測工具。

反向雜交技術(shù)最為關(guān)鍵的是探針設(shè)計(jì)。要求各種探針具有盡可能接近的Tm，并需進(jìn)行多次預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化探針長度、雜交溫度、雜交液和洗膜液濃度等。生物素標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，一般＜500 bp，否則會因位阻效應(yīng)影響膜上的寡核苷酸探針與生物素標(biāo)記的基因擴(kuò)增片段結(jié)合的效率和穩(wěn)定性；此外，雜交膜條在不同溶液間轉(zhuǎn)移速度太慢和顯色時(shí)間過長也會產(chǎn)生非特異性雜交信號，從而影響結(jié)果的正確判斷。

通過對啟東地區(qū)HBV前C區(qū)突變的檢測，結(jié)果顯示，前C區(qū)1896位點(diǎn)突變與肝癌發(fā)生具有相關(guān)性，這也與其他文獻(xiàn)的報(bào)道相一致［2，8］。HBV 1896位點(diǎn)突變可能是在宿主免疫壓力下產(chǎn)生的一種對前C區(qū)其他突變的補(bǔ)償機(jī)制，其出現(xiàn)可促進(jìn)HBV前C區(qū)基因突變，導(dǎo)致病毒持續(xù)感染，令肝細(xì)胞損傷加重［19］。另外本研究還發(fā)現(xiàn)在啟東地區(qū)HBV 1896位點(diǎn)突變雖有增加肝癌風(fēng)險(xiǎn)的趨勢，但尚未達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與本實(shí)驗(yàn)室之前對肝癌及非肝癌患者的HBV全基因序列比對分析的結(jié)果一致［4］。但也有報(bào)道1896位點(diǎn)突變與肝癌發(fā)生具有相關(guān)性的研究［7］。本研究樣本量較小，因此不能排除啟東地區(qū)G1896A突變與肝癌有相關(guān)性。此外，還可能與不同地區(qū)HBV流行株的基因型不同有關(guān)。Yang等［20］在臺灣地區(qū)的大規(guī)模分子流行病學(xué)研究結(jié)果顯示，與1896位點(diǎn)未發(fā)生突變的患者相比，發(fā)生1896位點(diǎn)突變患者具有較低的患肝癌風(fēng)險(xiǎn)。在以A基因型為主的西歐及北美地區(qū)，1858位點(diǎn)為C，1896位點(diǎn)不易突變；而以B、C基因型為主的亞洲地區(qū)，1858位點(diǎn)為U，1896位點(diǎn)易發(fā)生突變。臺灣及啟東地區(qū)均是以B、C基因型流行株為主［20］。

越來越多的數(shù)據(jù)表明HBV聯(lián)合突變較單點(diǎn)突變與進(jìn)展性肝臟疾病發(fā)生顯著相關(guān)。已報(bào)道的聯(lián)合突變包括HBV DNA前C區(qū)G1896A突變疊加X區(qū)中的A1762T/G1764A和C1653T突變時(shí)，將進(jìn)一步增加宿主罹患HCC的風(fēng)險(xiǎn)［21］。另外，Chen等［3］報(bào)道，同時(shí)發(fā)生HBV DNA G1899A、T1762/A1764和前S區(qū)缺失時(shí)，患者發(fā)生肝癌的風(fēng)險(xiǎn)是野生型病毒感染者的16.9倍?；诒卷?xiàng)研究中突變位點(diǎn)探針的設(shè)計(jì)原則和已優(yōu)化的雜交條件，我們還將建立檢測HBV DNA C區(qū)、X區(qū)和P區(qū)肝癌高發(fā)相關(guān)突變位點(diǎn)的反向雜交技術(shù)［4，7，22］，建立同張膜檢測突變位點(diǎn)的高通量方法，為肝癌高發(fā)風(fēng)險(xiǎn)模型的建立提供方法學(xué)的基礎(chǔ)。

綜上所述，反向雜交檢測HBV DNA前C區(qū)突變靈敏、方便、準(zhǔn)確，可檢測混合感染中10%以上的突變株，為肝癌預(yù)警提供了適合臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用的方法。

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Development and application of a reverse hybridization method for detection of hepatitis B virus precore mutation associated with hepatocellular carcinoma

ZHAO Zhi-mei1, ZHU Yu1, WU Yan1, FAN Chun-sun1, CHEN Tao-yang2, GAN Yu1, TU Hong1(1. State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Shanghai Cancer Institute, Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200032, China; 2.Qidong Liver Cancer Institute, Qidong Tumor Hospital, Qidong Jiangsu 226200, China)

TU Hong E-mail: tuhong@shsci.org

Background and purpose:It was reported that G1896A and G1899A mutation in the hepatitis B virus (HBV) precore region were all signi fi cantly associated with hepatocellular carcinoma (HCC). Simple, sensitive and reliable methods to detect precore mutations are needed in order to prevent the occurrence of HCC in clinical detection. The aim of this study was to develop a simple and sensitive reverse hybridization method for the detection of HBV precore mutation in HBV carriers. This method was applied for exploring the relationship between the precore mutations and HCC in patients of Qidong, Jiangsu Province.Methods:The speci fi c probes of nt.1896 and nt.1899 were designed and synthesized. In order to improve the sensitivity and specificity, reaction conditions of reverse hybridization were optimized. We used reverse hybridization to detect 50 HCC serum samples and compared the results with direct sequencing. Then we used this method to assess the association between HBV precore mutations and HCC in serum samples from 50 HCC patients and 50 non-HCC controls.Results:The detection limit of reverse hybridization for HBV DNA level was 103copy/mL and the sensitivity was 10% within a mixed virus population. The coincidence rate of reverse hybridization analysis was 98% compared with the direct sequencing results. It was showed that G1899A mutation was signi fi cantly associated with HCC compared to non-HCC controls (P=0.000, OR=4.846, 95%CI: 2.240-10.485), while G1896A mutation was not associated with HCC.Conclusion:Reverse hybridization is a simple andaccurate approach for the detection of low amounts of HBV precore mutants among a mixed viral population. It has potential usage in the large-scale screening of precore mutations in chronic hepatitis B carriers.

Hepatitis B virus; Precore domain; Reverse hybridization; Mutation; Hepatocellular carcinoma

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.04.005

R735.7

A

1007-3639(2014)04-0266-07

2014-01-26

2014-03-01）

國家十二五重大科技專項(xiàng)(No：2012ZX10002-008-002)。

屠紅 E-mail:tuhong@shsci.org