王玉林 王彪 孟欣 巴穎

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116011；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116011

BAG2對(duì)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)人甲狀腺癌細(xì)胞凋亡作用影響的觀察

王玉林1 王彪2 孟欣2 巴穎3

1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普外科，遼寧 大連 116011；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，遼寧 大連 116011

背景與目的：蛋白酶體抑制劑對(duì)不同組織來源的腫瘤均有抑制其增長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能與Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因2(Bcl-2-associated athanogene 2，BAG2)有關(guān)，本研究探討B(tài)AG2在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用。方法：選取人甲狀腺未分化癌細(xì)胞系A(chǔ)RO、FRO、KTC1、KTC2、KTC3、8305C和8505C，分別設(shè)培養(yǎng)液處理空白對(duì)照組、蛋白酶體抑制劑MG132處理組；利用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞BAG2 mRNA表達(dá)及MG132誘導(dǎo)其表達(dá)的時(shí)效性；利用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)各組細(xì)胞BAG2蛋白表達(dá)。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，F(xiàn)RO和KTC2細(xì)胞系對(duì)蛋白酶體抑制劑最為敏感，與空白對(duì)照組相比，MG132能不同程度的增加各種細(xì)胞BAG2 mRNA及蛋白的表達(dá)水平(P＜0.01)，在FRO和KTC2細(xì)胞中，BAG2 mRNA水平較對(duì)照組增加20～25倍，蛋白質(zhì)的表達(dá)水平也顯著增加；時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，敏感的FRO細(xì)胞BAG2 mRNA水平增加快，沒有延遲期；并且增加的最高水平顯著高于非敏感的ARO細(xì)胞(P＜0.01)。結(jié)論：BAG2是由蛋白酶體抑制作用誘導(dǎo)產(chǎn)生的新型分子，在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的甲狀腺癌細(xì)胞的死亡中起著促凋亡作用。

Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因2；蛋白酶體抑制劑；凋亡；甲狀腺腫瘤

蛋白酶體抑制劑對(duì)不同組織來源的腫瘤(包括實(shí)體腫瘤和血液惡性腫瘤)均有抑制其增長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［1］。盡管在臨床前期和臨床中獲得了蛋白酶體抑制劑治療腫瘤的一些證據(jù)，但這些藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍不十分清楚。因此，進(jìn)一步探討這些藥物作用的分子機(jī)制必將給優(yōu)化臨床應(yīng)用帶來益處。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，人Bcl-2相關(guān)抗凋亡基因(Bcl-2-associated athanogene，BAG)家族成員有6種(BAG1～6)，在酵母菌、無脊椎動(dòng)物、其他哺乳動(dòng)物和植物中均發(fā)現(xiàn)其同源蛋白［2］。所有BAG蛋白，羧端附近均含有保守的BAG結(jié)構(gòu)域，而氨基端大不相同［2-4］。BAG3作為能與HSP70組成復(fù)合物的蛋白被發(fā)現(xiàn)，是一種抗凋亡基因［5-6］，是應(yīng)用蛋白酶體抑制劑中影響凋亡效應(yīng)的一類破壞因子［7］。但BAG家族中其他成員在腫瘤中的作用，國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道，為此，本研究檢測(cè)蛋白酶體抑制劑MG132對(duì)不同人甲狀腺未分化癌細(xì)胞系中BAG2的影響，旨在探討B(tài)AG2在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)

人甲狀腺未分化癌細(xì)胞系A(chǔ)RO、FRO、KTC1、KTC2、KTC3由日本長(zhǎng)崎大學(xué)大學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究科山下俊一先生贈(zèng)予。8305C和8505C細(xì)胞系購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。這7種甲狀腺未分化癌細(xì)胞系是常見并廣為應(yīng)用研究的細(xì)胞系，惡性度高，細(xì)胞增殖及侵襲力強(qiáng)。所有細(xì)胞均于含10%胎牛血清DMEM1640 (購(gòu)自Sigma公司)培養(yǎng)基、37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、飽和濕度下培養(yǎng)，2～3 d傳代1次，選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞分組及干預(yù)處理

設(shè)立培養(yǎng)液處理空白對(duì)照組、蛋白酶體抑制劑處理組，分別向各組細(xì)胞中加入蛋白酶體抑制劑MG132(2 μmol/L，使用濃度參考張海燕等［8］的研究)和培養(yǎng)液，作用8 h；選取未分化甲狀腺癌細(xì)胞系A(chǔ)RO和FRO，分別代表對(duì)蛋白酶體抑制劑耐藥和敏感的細(xì)胞。分別向各組細(xì)胞中加MG132(2 μmol/L)，分別作用1、2、4、8、12、16、24和48 h。

1.3 四氮唑藍(lán)法行細(xì)胞生存分析

將細(xì)胞接種于96孔板(1×104/孔)，次日將各組細(xì)胞培養(yǎng)液更換成含2%胎牛血清培養(yǎng)液，并分別加入蛋白酶體抑制劑MG132培養(yǎng)24 h。參照文獻(xiàn)［9］，每孔加培養(yǎng)液180 μL和5 mg/mL MTT(購(gòu)自Sigma公司)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加150 μL二甲基亞砜(購(gòu)自Sigma公司)，搖床震搖15 min，置酶標(biāo)儀(Ascent Software Version 2.4)測(cè)492 nm處的吸光度值(A值)，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(IR) =(A空白對(duì)照組-A實(shí)驗(yàn)組)/A空白對(duì)照組×100%。

1.4 實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞BAG2 mRNA表達(dá)

收集各組細(xì)胞，參照文獻(xiàn)［10］，采用異硫氰酸肌法提取總RNA，用Oligo(dT) 12-18和SuperscriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，用雙標(biāo)記熒光探針混合物(SYBR Green PCR Master mix)在ABI prism7000自動(dòng)序列分析系統(tǒng)中采用qRT-PCR進(jìn)行分析，每組重復(fù)3次。BAG2基因引物特異序列順義鏈：5′-CTTTGAGAGAAGCAGCAACTG-3′，反義鏈：5′-TGACACTTCAACGGTGAGAG-3′。β-actin作為內(nèi)參照，其引物特異序列順義鏈：5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′，反義鏈：5′-GGATCTTCATGAGGTAGTCAG-3′。BAG2擴(kuò)增結(jié)果用β-actin進(jìn)行標(biāo)化。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測(cè)BAG2蛋白表達(dá)

收集各組細(xì)胞，用含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl；150 mmol/L NaCl；2 mmol/L EDTA；1% Triton X-100)裂解破碎離心后，用BCA蛋白分析試劑盒對(duì)上清蛋白進(jìn)行定量。以20 μg等量的蛋白上樣，

用12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉TBST封閉后，依次進(jìn)行一抗鼠抗人BAG2(購(gòu)自美國(guó)Alexis Biochemicals公司)4 ℃溫育過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫溫育1 h，進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯像。以鼠抗人γ-tubulin單克隆抗體(購(gòu)自中國(guó)Sigma-Aldrich公司)作為內(nèi)參照，應(yīng)用NIH IMAGE 1.4軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析；以γ-tubulin標(biāo)化后各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組蛋白A值的比值作為產(chǎn)物相對(duì)含量。

1.6 SiRNA敲低BAG2表達(dá)檢測(cè)MG132作用

B A G 2特異性s i R N A序列C C A U CAAGCUAUUAGAGCAUU用于敲低BAG2表達(dá)，與已知基因無同源的siRNA序列CCGU A U C G U A A G C A G U A C U最為對(duì)照。LipofectamineTM2000(Invitrogen，CA，USA)作為載體，依手冊(cè)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞系，MG132作用后檢測(cè)凋亡細(xì)胞比率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同甲狀腺癌細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑MG132的敏感性

通過MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，作用24 h后ARO和8305C細(xì)胞系幾乎無變化，其細(xì)胞死亡是有限的，即使高濃度蛋白酶體抑制劑作用下，細(xì)胞死亡率仍低于30%，提示其對(duì)蛋白酶體抑制劑完全不敏感；FRO和KTC2細(xì)胞系IC50范圍為0.5～1 μmol/L，提示其反應(yīng)最敏感；KTC1和KTC3細(xì)胞系IC50值于藥物濃度較高水平，為1～2.0 μmol/L，對(duì)蛋白酶體抑制劑呈中度敏感(圖1)。

2.2 蛋白酶體抑制劑對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2 mRNA表達(dá)的影響

圖1 蛋白酶體抑制劑MG132作用24 h對(duì)各種甲狀腺癌細(xì)胞的不同殺傷作用Fig. 1 Killing effect of proteasome inhibitor MG132 for thyroid cancer cell lines within 24 h

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明：蛋白酶體抑制劑MG132(2 μmol/L)作用于甲狀腺未分化癌細(xì)胞8 h后，BAG2 mRNA表達(dá)水平均不同程度明顯高于空白對(duì)照組(P＜0.01)。在FRO和KTC2細(xì)胞中，BAG2 mRNA水平較對(duì)照組增加20～25倍，而在其他細(xì)胞中，觀察到BAG2 mRNA水平僅增加3～10倍(圖2A)。

2.3 蛋白酶體抑制劑對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2 蛋白合成的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與觀察到的BAG2 mRNA的不同誘導(dǎo)作用相一致，BAG2蛋白的表達(dá)在FRO和KTC2中顯著增加，但是在ARO、8305C和8505C中僅有輕微的增加(圖2B)。

2.4 蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2 mRNA的時(shí)效分析

實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，在MG132敏感的FRO細(xì)胞中，BAG2 mRNA水平的增加起始沒有明顯的時(shí)間間隔，早在1 h時(shí)，BAG2表達(dá)即顯著增加，作用8 h達(dá)到高峰；作用16 h后，由于大量細(xì)胞死亡BAG2的表達(dá)逐漸下降(圖2A)。MG132耐藥的ARO細(xì)胞中，BAG2 mRNA開始蓄積前有8～16 h的延后，作用8 h首次觀察到BAG2的顯著增加，24～48 h達(dá)到頂峰(圖2B)。另外，與FRO細(xì)胞組相比，ARO細(xì)胞中BAG2 mRNA誘導(dǎo)的最高水平較前者顯著升高(P＜0.01，圖3)。

2.4 敲低BAG2表達(dá)后MG132作用結(jié)果

圖2 MG132上調(diào)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2 mRNA及蛋白的表達(dá)Fig. 2 Upregulation of BAG2 in various type of cancer cells treated with MG132

圖3 MG132上調(diào)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2 mRNA的時(shí)效分析Fig. 3 Time course of induction of BAG2 transcription by MG132

SiRAN轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞系后，BAG2蛋白表達(dá)水平顯著降低，MG132誘導(dǎo)凋亡結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染導(dǎo)致BAG2蛋白表達(dá)下調(diào)在一定程度上延遲并抑制了MG132的凋亡誘導(dǎo)作用(P＜0.01，圖4)。

圖4 敲低BAG2后MG132凋亡誘導(dǎo)作用研究Fig. 4 Down-regulation of BAG2 delayed and partially suppressed MG132-induced cell death

3 討 論

BAG2蛋白是BAG家族中的成員之一。近來，有文獻(xiàn)報(bào)道BAG2與熱休克蛋白70-C端相互影響蛋白(carboxyl terminus of heat shock protein 70-interacting protein，CHIP)的羧基端相互作用［11-12］，HSP70相關(guān)的遍在蛋白連接酶通過與細(xì)胞質(zhì)的分子伴侶蛋白相關(guān)的泛素錯(cuò)誤折疊蛋白參與泛素蛋白酶體系統(tǒng)［13］。BAG2通過CHIP以分子伴侶蛋白依賴的調(diào)節(jié)機(jī)制來抑制錯(cuò)誤折疊蛋白的泛素化［11-12］，提示BAG2在調(diào)節(jié)蛋白酶體介導(dǎo)的伴侶蛋白底物的降解中起著內(nèi)源的作用。目前，除了知曉BAG2可以抑制CHIP的作用外，對(duì)BAG2的誘導(dǎo)作用及其正常功能了解甚少。本研究首次報(bào)道了蛋白酶體抑制劑對(duì)BAG2的誘導(dǎo)作用，并且這種誘導(dǎo)作用與其對(duì)甲狀腺未分化癌的不同殺傷作用有關(guān)。

本研究先前的研究證實(shí)不同的甲狀腺未分化癌細(xì)胞系對(duì)蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有不同的敏感性：FRO和KTC2對(duì)蛋白酶體抑制劑是最敏感的，而ARO和8305C是最耐藥的［14］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在敏感的FRO和KTC2細(xì)胞中，MG132對(duì)BAG2基因的誘導(dǎo)作用無論是mRNA水平還是蛋白水平均明顯高于其他耐藥細(xì)胞。提示在對(duì)蛋白酶體抑制劑敏感的細(xì)胞中，BAG2更易被誘導(dǎo)上調(diào)；上調(diào)的BAG2可能

加強(qiáng)蛋白酶體抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。

時(shí)效分析中，我們選取了最為敏感的FRO和耐藥的ARO細(xì)胞系作為代表進(jìn)行分析，在蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2的時(shí)效分析實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在敏感的FRO細(xì)胞中，BAG2上調(diào)快、幅度大；而耐藥的ARO細(xì)胞中，BAG2上調(diào)延遲、幅度小。與我們先前研究的結(jié)果密切相關(guān)［14］，即蛋白酶體抑制劑對(duì)FRO細(xì)胞起效快，細(xì)胞凋亡率高；而對(duì)耐藥的ARO細(xì)胞起效慢，細(xì)胞凋亡率低。這可能提示BAG2在誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌細(xì)胞凋亡中與蛋白酶體抑制劑起協(xié)同作用。

本研究應(yīng)用SiRNA技術(shù)下調(diào)FRO細(xì)胞系中BAG2的表達(dá)，繼續(xù)用MG132處理后發(fā)現(xiàn)，MG132的凋亡誘導(dǎo)作用被延遲并在一定程度上被抑制，這一結(jié)果提示BAG2在細(xì)胞凋亡中與MG132發(fā)揮著協(xié)同作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)蛋白酶體抑制劑可以誘導(dǎo)甲狀腺未分化癌細(xì)胞中BAG2的生成；BAG2的上調(diào)使得細(xì)胞對(duì)蛋白酶體抑制劑更為敏感，提示BAG2在應(yīng)答蛋白酶體抑制劑中可能具有促進(jìn)凋亡的作用。為此，進(jìn)一步探討B(tài)AG2的促凋亡作用機(jī)制可能促進(jìn)我們理解BAG家族蛋白的作用，為更好的優(yōu)化應(yīng)用蛋白酶體抑制劑治療腫瘤提供理論依據(jù)。

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Induction of BAG2 in proteasome inhibitor-induced apoptosis in human thyroid carcinoma cells

WANG Yu-lin1,WANG Biao2, MENG Xin2,BA Ying3(1. Department of General Surgery, First Af fi liated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, China Medical University, Shenyang Liaoning 110001, China; 3. Department of Endocrinology, First Af fi liated Hospital of Dalian Medical University, Dalian Liaoning 116011, China)

Background and purpose:For neoplasms with different sources, proteasome inhibitors can inhibit their growth and promote the cell apoptosis. Its mechanism may be associated with Bcl-2-associated athanogene 2 (BAG2). We aimed to investigate the involvement of in thyroid cancer cell death induced by proteasome inhibitors.Methods:A panel of thyroid cancer cells (ARO, FRO, KTC1, KTC2, KTC3, 8305C and 8505C) were treated with vehicle or proteasome inhibitor MG132; BAG2 mRNA and protein levels were analyzed using quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot, respectively.Results:MTT results indicated that FRO and KTC2 cell lines were the most sensitive to proteasome inhibitors. MG132 induced BAG2 mRNA and protein expression in the panel of thyroid cancer cells with various degree (P＜0.01), for FRO and KTC2 cell line, the BAG2 mRNA level was increased in 20 to 25 times, meanwhile the protein expression level also increased signi fi cantly; Sensitive FRO cells demonstrated quicker induction of BAG2 compared with insensitive ARO cells. Moreover, the extents of BAG2 induction in FRO cells were higher than that in ARO cells.Conclusion:BAG2 is a novel molecule induced by proteasome inhibitor, which might function as a proapoptotic molecule in thyroid cancer cell death mediated by proteasome inhibitor.

Bcl-2-associated athanogene 2; Proteasome inhibitor; Apoptosis; Thyroid cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.05.005

R736.1

A

1007-3639(2014)05-0349-05

2014-01-10

2014-03-20）

巴穎 E-mail:baying12676@126.com