擬南芥AtLCR23基因組織表達分析

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（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128）

擬南芥AtLCR23基因組織表達分析

易力雄1，郭磊2，周雅智1，劉春林2，阮穎1*

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128）

AtLCR23是擬南芥LCR基因家族中一個功能未知基因。目前有限的研究表明，擬南芥LCR家族中部分蛋白參與了植物防御機制。本研究通過半定量RT-PCR檢測，AtLCR23主要在開放的花和幼嫩果莢中表達。構(gòu)建pAtLCR23：：AtLCR23：GUS融合表達載體，并對轉(zhuǎn)基因植株進行組織化學(xué)染色，結(jié)果表明：AtLCR23基因特異性表達于已授粉的花和幼嫩果莢的柱頭，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推測AtLCR23的功能可能與花粉識別相關(guān)。

擬南芥；AtLCR23；基因表達；RT-PCR；GUS染色

在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中，LCR基因家族有86個成員，其家族蛋白通常含有一段信號肽序列，一般都屬于分泌蛋白，且分子量較小，都不超過12 kDa［1］。多序列比對結(jié)果表明除都含有8個高度保守的半胱氨酸外，家族成員的同源性較低。LCR基因家族除LCR27和LCR71外，其他基因都在靠近5′端有一段長約75～275 bp的內(nèi)含子序列［1］。據(jù)現(xiàn)有研究表明，擬南芥LCR基因家族包含一類DEFL（Defensin -like）蛋白，稱為類防御蛋白，這一類蛋白與抗病原菌相關(guān)，又稱為抗微生物肽［2］。DEFL蛋白是一種分布很廣的蛋白，據(jù)統(tǒng)計，自然界的每一個物種體內(nèi)都存在15～50個不同的防御蛋白［3，4］。在擬南芥中現(xiàn)在已經(jīng)分離出了317個DEFL蛋白，其中有明確的注釋且能表達完整的cDNA獲得EST序列的蛋白占20%，確定具有防御功能的蛋白只有15個［5］，其中有11個就屬于LCR基因家族。

此外，LCR基因家族中還包含一些編碼PCP蛋白（Pollen coat protein）的成員。PCP蛋白是一種富含半胱氨酸的小分子量花粉外包壁蛋白，能與SLG和SLR1相互作用，使成熟的花粉可以粘著在柱頭上順利完成花粉管的萌發(fā)以及受精［6］，避免了自交不親和現(xiàn)象（self-incompatibility，SI）。孢子體自交不親和性（sporophytic self-incompatibility，SSI）普遍存在于十字花科蕓薹屬植物中，通常是不親和的花粉在柱頭表面萌發(fā)受到了抑制［7］。分子水平上由S -位點復(fù)等位基因控制，當花藥中編碼的基因是SCR（S locus cysteine-rich protein）或SP11家族，同時柱頭中編碼的基因是SRK（S locus receptor kinase）家族時，自花授粉后會發(fā)生SSI現(xiàn)象［8］。擬南芥LCR基因家族中，包括AtLCR23在內(nèi)大部分成員都編碼了SLR1-BP（S locus-related glycoprotein 1 binding pollen coat protein domain）蛋白結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可以特異性識別SSI現(xiàn)象中與S-位點非連鎖功能分子SLR1。SLR1（S locus-related glycoprotein 1）是一種大量存在于柱頭乳突細胞中的分泌蛋白。Takayama等通過實驗發(fā)現(xiàn)，反義SLR1轉(zhuǎn)基因植物中當柱頭SLR1含量下降時其花粉的粘著力也大大下降［9］。

但是，目前對LCR基因家族的功能研究總體仍不清楚，特別是擬南芥LCR基因的時空表達模式缺乏相關(guān)的研究和描述。為了研究AtLCR23基因組織表達定位，筆者通過RT-PCR檢測與構(gòu)建GUS融合表達載體pAtLCR23：：AtLCR23：GUS，轉(zhuǎn)化擬南芥哥倫比亞野生型（Col），并對轉(zhuǎn)化植株進行GUS化學(xué)染色，確定了該基因的時空表達模式，為下一步功能研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞生態(tài)型（Col），大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α，根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101，表達載體pBI101、pMD-19，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物發(fā)育與表觀遺傳調(diào)控實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)條件

將擬南芥Col種子播種于裝有蛭石的小缽中，用1／10MS營養(yǎng)液灌澆浸透，保鮮膜封口，避光4℃處理約3 d，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室揭膜，生長條件是22～25℃，長日照（16 h光／8 h暗），定期澆灌營養(yǎng)液。1.2.2 RT-PCR檢測AtLCR23在擬南芥不同組織中的表達

通過查詢TAIR網(wǎng)站（http：／／www.arabidopsis. org／）AtLCR23基因cDNA序列，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計RT-PCR檢測引物RTLCR23-F／RTL CR23R。引物序列分別為：

RTLCR23-F：5′-ATGGCCAACATATCATG GTCTCATTTTC-3′

RTLCR23R：5′-TTAACAATTATAAGTACACA CACAATTAGGAGT-3′

待擬南芥生長40～50 d，分別取Col野生型的根、莖、葉、花芽、花、開花后生長2、4、6、8 d的果莢，采用Trizol法［10］提取各個組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用設(shè)計好的RT-PCR引物RTLCR23-F／RTLCR23R進行PCR檢測，預(yù)期目的片段大小為234 bp。

1.2.3 pAtLCR23：：AtLCR23：GUS表達載體構(gòu)建

從TAIR網(wǎng)站查詢到AtLCR23基因上游啟動子區(qū)域序列及基因組全長序列，去除終止密碼子（-976～＋370 bp），設(shè)計擴增引物PLCR23-F／PL CR23-R，并在上下游引物5′端分別加上Xba I和BamH I酶切位點，PCR擴增預(yù)期擴增的目的片段大小為1 346 bp?？寺∫镄蛄袨椋?/p>

TATTATTAGCCTTAAT-3′（下劃線標記為Xba I酶切位點）

TATAAGTACACACACAATTAGGAGT-3′（下劃線標記為BamH I酶切位點）

CTAB法［11］提取擬南芥葉片總DNA，以總DNA為模板，用引物PLCR23-F／PLCR23-R進行PCR擴增，回收目的片段，連接到TAKARA公司pMD-19載體上，通過熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，PCR檢測出陽性克隆送于測序。用Xba I、BamH I對測序正確的pMD-19-PLCR23和pBI101進行雙酶切，回收目的片段和目的載體。T4連接酶16℃過夜連接。

1.2.4 擬南芥轉(zhuǎn)化與GUS染色

提取質(zhì)粒通過凍融法［12］將構(gòu)建好的載體pAtL CR23：：AtLCR23：GUS轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌GV3101中，進行菌落PCR鑒定和雙酶切驗證。挑選出陽性菌落放置于加有慶大霉素（30 mg／L）、卡那霉素（50mg／L）、利福平（100 mg／L）的YEB培養(yǎng)液中活化擴大。采用浸花法［13］轉(zhuǎn)化Col野生型擬南芥。收集T0代種子播種于含有卡那霉素篩選濃度為30 mg／L的MS固體培養(yǎng)基上，長日照培養(yǎng)2周后將抗性苗移至含有營養(yǎng)液的蛭石中正常生長。

設(shè)計載體檢測引物pBI101-F／pBI101-R，其中下游引物pBI101-R設(shè)計在載體GUS基因區(qū)域，預(yù)期片段大小為1 426 bp。引物序列分別為：

pBI101-F：5′-TGCACACTCTATTATTAGCCT TAAT-3′

pBI101-R：5′-CCGCATAATTACGAATATCT GCATC-3′

用CTAB法提取抗性植株葉片的總DNA，以總DNA為模板，用檢測引物pBI101-F／pBI101-R進行PCR檢測。

選取檢測結(jié)果為陽性的植株進行GUS化學(xué)染色［14］處理，同時取相同生長狀況的Col野生型擬南芥做對照。取新鮮組織，放于90%丙酮溶液中15 min，冰上操作。去除丙酮溶液，用超純水洗滌1次，將組織轉(zhuǎn)移到GUS染液中，500～700 mmHg真空抽氣10 min，37℃染色3～6 h，染色后去除GUS染液，用70%乙醇37℃脫色5～10 h后觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 AtLCR23基因在擬南芥不同組織中的表達情況

分別從Col野生型擬南芥的根、莖、葉、花芽、花和開花后生長2、4、6、8 d的果莢中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以擬南芥ACTIN2為內(nèi)參，通過RTPCR檢測AtLCR23基因的表達情況。結(jié)果顯示：AtL CR23在擬南芥正在開放的花中有較高的表達，在開花后生長2、4 d的果莢中有較弱的表達，在其他組織器官中都沒有檢測到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，說明AtL CR23基因主要在已授粉的花中和幼嫩的果莢中特異性表達（圖1）。

圖1 擬南芥不同組織中AtLCR23基因的表達結(jié)果Fig.1 Expression of AtLCR23 gene in different tissues of Arabidopsis

2.2 GUS表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化鑒定

為進一步確定AtLCR23基因時空表達模式，利用PCR克隆了AtLCR23基因上游啟動子區(qū)域序列及基因組全長序列，連接到中間載體pMD-19送去測序。利用Xba I和BamH I雙酶切pMD-19-PL CR23陽性克隆和pBI101，將目的片段連接到帶有報告基因GUS的pBI101載體上，構(gòu)建成了pAtL CR23：：AtLCR23：GUS融合表達載體（圖2）。為了驗證載體的正確性，對pAtLCR23：：AtLCR23：GUS進行Xba I和BamH I雙酶切（圖3）。結(jié)果顯示：目的片段與預(yù)期結(jié)果相符，表明GUS表達載體構(gòu)建成功。

圖2 pAtLCR23：：AtLCR23：GUS表達載體示意圖Fig.2 Schematic diagram of pAtLCR23：：AtLCR23：GUS

圖3 pAtLCR23：：AtLCR23：GUS表達載體雙酶切檢測Fig.3 Identification of pAtLCR23：：AtLCR23：GUS vector by restriction enzyme digestion

注：M.Mark；1～2.pAtLCR23：：AtLCR23：GUS經(jīng)Xba I和BamH I雙酶切；3.未酶切對照。

將構(gòu)建好的pAtLCR23：：AtLCR23：GUS表達載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化Col野生型擬南芥，獲取帶有抗卡那霉素抗性的植株（圖4）。移至蛭石中正常生長，并提取葉片總DNA，用檢測引物pBI101-F／pBI101-R進行PCR檢測（圖5）。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)基因植株基因組序列中導(dǎo)入了目的片段。

圖4 陽性植株篩選Fig.4 Screening of positive transformantskanam ycin-resistant seed lings

圖5 GUS轉(zhuǎn)化子檢測Fig.5 Identification of GUS transformants

2.3 GUS染色定位AtLCR23基因表達

將篩選到的pAtLCR23：：AtLCR23：GUS轉(zhuǎn)基因植株進行GUS組織化學(xué)染色處理，分別選取生長5 d的幼苗整株染色，待植株生長約35 d取整個花序染色，以及開花后生長2、4、8 d果莢染色，同時以相同生長狀態(tài)下的Col野生型擬南芥做為對照，結(jié)果如圖6所示。從圖6-A可以觀察到在擬南芥營養(yǎng)生長階段，AtLCR23基因在生長5 d的幼苗中各個組織中都沒有表達，而在擬南芥生殖生長階段的花中，且只在已經(jīng)授粉的花的柱頭有表達（圖6-C），而在未授粉的花芽中沒有表達（圖6-C）。在成熟的花中主要在柱頭表達，在花絲和花藥中有微量的表達（圖6-E）。此外還在開花后生長2、4 d的果莢（圖6-I、M）柱頭上有表達（圖6-K、O），在生長8 d果莢中沒有檢測到表達（圖6-Q、S）。綜上所述，經(jīng)GUS組織化學(xué)染色后，AtLCR23基因主要在授粉后成熟雌蕊的柱頭上表達。

3 討論

圖6 pAtLCR23：：AtLCR23：GUS在擬南芥各個組織中的表達情況Fig.6 Expression of pAtLCR23：：AtLCR23：GUS in different tissues of Arabidopsis

自交不親和性（self-incompatibility，SI）是植物特異性識別并抵制自身產(chǎn)生的花粉或親緣關(guān)系較近的花粉，從而促進異花授粉的一種生殖隔離現(xiàn)象，由S位點復(fù)等位基因控制?，F(xiàn)在研究比較清楚的是孢子體自交不親和（簡稱SSI）現(xiàn)象，多發(fā)生于十字花科蕓薹屬中［15］。S-位點上的基因高度多樣化，當花粉和雌蕊心皮上是同一個S-位點蛋白相互識別時就會引發(fā)自交不親和反應(yīng)，現(xiàn)在已經(jīng)分離出3類與S-位點連鎖的基因：位于雌蕊柱頭中的SLG和SRK，以及位于花粉外包壁中的SCR／SP11［16］。此外調(diào)控SSI現(xiàn)象還有一些與S位點非連鎖的功能分子，其中SLR1是由S基因家族編碼的一種分泌型蛋白，大量存在雌蕊柱頭乳突細胞中，其功能是參與花粉識別柱頭時所需粘著力大小相關(guān)，且SLR的一級結(jié)構(gòu)與雌蕊S基因編碼的分泌型柱頭特異識別糖蛋白SLG十分相似。在Takayama［9］等研究中發(fā)現(xiàn)并純化出兩種與SLR1特異性識別的結(jié)合蛋白SLR1-BP1、SLR1-BP2。而在LCR基因家族中，包括AtLCR23基因在內(nèi)，絕大部分基因都編碼了SLR1-BP蛋白結(jié)構(gòu)域。筆者在本研究中通過RT-PCR檢測到AtLCR23主要在已授粉花和幼嫩果莢中有表達，而后構(gòu)建了GUS融合表達載體，轉(zhuǎn)化并進行GUS化學(xué)染色，觀察到AtLCR23具體在已授粉花的柱頭及花絲花藥中和發(fā)育前期果莢的柱頭上有表達，進一步驗證了前面RT-PCR的結(jié)果。綜上所述，本研究鑒定出了AtLCR23組織表達模式，推測AtLCR23的功能可能與花粉識別機制相關(guān)，為進一步揭示LCR基因家族功能提供參考線索。

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Expression Analysis of AtLCR23 Gene in Arabidopsis thaliana

YILi-xiong1，GUO Lei2，ZHOU Ya-zhi1，LIU Chun-lin2，RUAN Ying1*

（1 College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；
2 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

AtLCR23 is a function unknown gene which belong to LCR families in Arabidopsis.Currently limited researches showed a partof LCR proteinswere involved in plant defensemechanisms.Semi-quantitative RT-PCR confirmed AtLCR 23 mainly expressed in opening flowers and young siliques.Construction of pAtLCR23：：AtLCR23：GUS reporter line and histochemical staining of transgenic plants showed that AtLCR23 was specific expressed in stigma of pollinated flowers and young siliques.Combined with bioinformatics analysis，the results showed the function of AtLCR23 may be associated with pollen identification.

Arabidopsis thaliana；AtLCR23；Gene expression；RT-PCR；GUS-staining

Q786

A

1001-5280（2014）03-0246-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.04

2014 03 12

易力雄（1988-），男，湖南婁底人，碩士研究生，Email：xiong-mao.168＠163.com。*通信作者，阮穎，教授，Email：yingruan＠htomail.com。

國家自然科學(xué)基金項目（31071455）。