HMGB1基因沉默對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧所致星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

汶海琪，羅勇，陳瑞芳，李滿，龐月珊，謝宸宸

腦缺血為臨床常見(jiàn)病和多發(fā)病，缺血再灌注損傷是其重要的病理?yè)p傷環(huán)節(jié)，研究其機(jī)制對(duì)該病的臨床治療具有重要意義。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1，HMGB1)作為一種重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血后表達(dá)量明顯升高并可持續(xù)數(shù)周[1-2]，釋放后主要和細(xì)胞表面的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)、Toll樣受體2(Toll like receptors，TLR-2)、Toll樣受體4(TLR-4)結(jié)合，促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起下游炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而引起組織細(xì)胞損傷[3]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為大腦中數(shù)量最多的細(xì)胞，具有支持、營(yíng)養(yǎng)、信號(hào)傳遞等重要作用，越來(lái)越多的證據(jù)表明其在腦缺血再灌注損傷中扮演著重要角色[4-6]。本研究通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默HMGB1的表達(dá)，在體外對(duì)大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)氧以模擬在體腦缺血再灌注損傷，觀察HMGB1表達(dá)的變化情況，探討RNA干擾抑制HMGB1表達(dá)是否對(duì)氧糖剝奪/復(fù)氧的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新生24h內(nèi)Sprague-Dawley大鼠40只，雌雄兼有，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(渝)2012-0001。

1.2 主要試劑 DMEM高糖、胎牛血清(美國(guó)Gibco)，無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基(中國(guó)鈕因華信)，慢病毒載體HMGB1siRNA試劑盒(上海吉?jiǎng)P公司)，HMGB1抗體(美國(guó)Abcam)，GFAP抗體(美國(guó)CST公司)，β-actin抗體、兔抗羊IgG抗體、羊抗小鼠FITC、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗、MTT試劑盒、蛋白測(cè)定試劑盒、蛋白裂解試劑盒(碧云天)，HMGB1ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢華美)，LDH檢測(cè)試劑盒(南京建成)，RT-PCR試劑盒(日本TaKaRa)。

1.3 方法

1.3.1 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 取出生24h以內(nèi)的新生SD乳鼠，在無(wú)菌條件下剪取出大腦皮質(zhì)，以2.5g/L胰蛋白酶37℃消化30min后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打后200目篩網(wǎng)過(guò)濾，1000r/min離心5min，取離心后沉淀，加入培養(yǎng)液吹打形成次細(xì)胞懸液，利用差速黏附法將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱30min后，倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，吸出液體，800r/min離心5min，棄去上清液，再加入完全培養(yǎng)基形成細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)后按5.0×104個(gè)/cm2密度置于已包被多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，置CO2孵箱中37℃培養(yǎng)，3d換液1次，培養(yǎng)至第3代得到成熟的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞[7]，用針對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫細(xì)胞化學(xué)法對(duì)所培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定及純度計(jì)算。

1.3.2 RNA干擾原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的HMGB1表達(dá)慢病毒包裝HMGB1-RNA干擾序列參考Hayakawaa等[8]的報(bào)道，由上海吉?jiǎng)P公司合成，序列為5'-GAT CCCGAAGCACCCGGATGCTTCTTTCAAGAGAAG AAGCATCCGGGTGCTTCTTTTTTGGAAA-3'。將星形膠質(zhì)細(xì)胞分為3組：①未轉(zhuǎn)染HMGB1siRNA的正常星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)照組；②HMGB1siRNA組：轉(zhuǎn)染慢病毒載體的HMGB1siRNA，轉(zhuǎn)染操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行；③非特異性siRNA組：轉(zhuǎn)染非特異性慢病毒載體的siRNA，方法同HMGB1siRNA轉(zhuǎn)染步驟。Western blotting檢測(cè)以上各組細(xì)胞質(zhì)中HMGB1蛋白表達(dá)水平：用2×SDS加樣緩沖液裂解細(xì)胞，收集蛋白質(zhì)，采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉后，加入兔抗大鼠HMGB1抗體、小鼠抗大鼠β-actin后4℃過(guò)夜，用TBST洗3次，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗，室溫孵育2h，TBST洗3次，DAB顯色，拍照，用Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度值分析。

1.3.3 氧糖剝奪/復(fù)氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 建立氧糖剝奪/復(fù)氧模型[9]：取第3代原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，PBS沖洗3次，換為不含血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣孵箱(1%O2、5%CO2)中，在不同時(shí)長(zhǎng)的氧糖剝奪后，再換回含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，置于20%O2、5%CO2的正常細(xì)胞培養(yǎng)條件下復(fù)氧培養(yǎng)至24h。將原代成熟純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、HMGB1siRNA組、非特異性siRNA組。對(duì)照組：細(xì)胞未行氧糖剝奪/復(fù)氧及RNA干擾處理。模型組：細(xì)胞分別行2、4、6h的氧糖剝奪后復(fù)氧至24h。HMGB1siRNA組：氧糖剝奪前對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞行HMGB1siRNA轉(zhuǎn)染，然后氧糖剝奪6h并復(fù)氧至24h。非特異性siRNA組：氧糖剝奪前對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行非特異性siRNA轉(zhuǎn)染，然后氧糖剝奪6h后復(fù)氧至24h。

1.3.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞使用MTT試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率，具體操作步驟按說(shuō)明書進(jìn)行，最后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)吸光度(A)值。

1.3.5 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率檢測(cè) 各組星形膠質(zhì)細(xì)胞按LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行LDH活性測(cè)定，用乳酸脫氫酶-L試劑測(cè)試待測(cè)樣品中的LDH漏出率。LDH漏出率=培養(yǎng)基LDH總活性/(細(xì)胞質(zhì)LDH總活性+培養(yǎng)基LDH總活性)×100%。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè)HMGB1mRNA表達(dá) 按照Trizol試劑說(shuō)明提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后行PCR。HMGB1引物：上游5'-AATCTTTTGTCCACACACCCT-3'，下游5'-TATCCGCTTTCCTTGTATCTG-3'；β-actin引物：上游5'-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3'，下游5'-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3'。產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為552、150bp。反應(yīng)體系25μl，PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s、62℃退火45s、72℃延伸1min，循環(huán)35次；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳成像，采用Quantity One系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度值分析，以HMGB1/β-actin積分光密度比值代表HMGB1mRNA表達(dá)水平。

1.3.7 ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1蛋白的濃度按照ELISA試劑盒操作說(shuō)明書步驟，每個(gè)樣本取細(xì)胞培養(yǎng)上清液100μl，檢測(cè)各組星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后培養(yǎng)上清中HMGB1蛋白的濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Turkey多重比較法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定 取培養(yǎng)3代的大鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，采用GFAP熒光染色鑒定，結(jié)果顯示，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度>95%(圖1)。

圖1 GFAP鑒定原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞(×200)Fig. 1GFAP immunofluorescence staining of primarily cultured astrocytes (×200)

2.2 Western blotting檢測(cè)RNA干擾效果 與對(duì)照組(6.51±0.46)相比，HMGB1siRNA組HMGB1蛋白表達(dá)量(2.17±0.51)明顯降低(P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1蛋白表達(dá)量(6.00±0.79)g與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示HMGB1siRNA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的HMGB1蛋白表達(dá)具有明顯抑制作用(圖2)。

圖2 Western blotting檢測(cè)HMGB1蛋白表達(dá)Fig. 2Expression of HMGB1protein detected by Westernblotting

2.3 星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后HMGB1的表達(dá)變化

2.3.1 HMGB1mRNA的表達(dá) RT-PCR法檢測(cè)顯示，對(duì)照組有少量HMGB1mRNA表達(dá)(0.07±0.01)。與對(duì)照組相比，模型組HMGB1mRNA在2h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)表達(dá)明顯增加(0.16±0.01，P<0.01)，在4h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)進(jìn)一步增高(0.26±0.02，P<0.01)，6h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)達(dá)最高值(0.41±0.02，P<0.01)。與6h氧糖剝奪組比較，HMGB1siRNA組的HMGB1mRNA表達(dá)明顯下降(0.20±0.01，P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1mRNA表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.42±0.01，P>0.05，圖3)。

圖3 氧糖剝奪/復(fù)氧后星形膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1mRNA的表達(dá)變化Fig.3Expression of HMGB1mRNA detected by RT-PCR

2.3.2 細(xì)胞上清液中HMGB1蛋白濃度 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞上清液中有一定量HMGB1表達(dá)(472±53pg/ml)。與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞上清液中HMGB1蛋白濃度在2h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)表達(dá)明顯增加(538±85pg/ml，P<0.01)，在4h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)進(jìn)一步增高(659±47pg/ml，P<0.01)，在6h氧糖剝奪/復(fù)氧24h時(shí)達(dá)最高值(784±63pg/ml，P<0.01)。與氧糖剝奪6h組相比較，HMGB1siRNA組HMGB1濃度明顯下降(588±65pg/ml，P<0.01)，而非特異性siRNA組HMGB1濃度無(wú)明顯差異(743±46pg/ml，P>0.05)。

2.4 星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞損傷情況

2.4.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后LDH漏出率的變化 與對(duì)照組(1.14±0.20)相比，不同時(shí)間點(diǎn)氧糖剝奪/復(fù)氧組LDH漏出率均明顯增加(P<0.01)，且隨著缺氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高。與氧糖剝奪6h組(63.63±4.30)相比，HMGB1siRNA組的LDH漏出率明顯下降(43.80±3.43，P<0.01)，而非特異性siRNA組LDH漏出率無(wú)明顯差異(63.93±2.40，P>0.05，表1)。

表1 氧糖剝奪/復(fù)氧星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞存活率和LDH漏出率比較(x±s，n=6)Tab. 1Effects of HMGB1siRNA on the survival rate and LDH activity of OGD/R astrocytes (x±s, n=6)

2.4.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后細(xì)胞存活率的變化 MTT檢測(cè)顯示，與對(duì)照組(100.00±1.43)相比，不同時(shí)間點(diǎn)氧糖剝奪/復(fù)氧組細(xì)胞存活率均明顯降低(P<0.01)，且隨缺氧時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。與氧糖剝奪6h組(35.00±1.92)相比，HMGB1siRNA組細(xì)胞存活率明顯提高(75.00±2.13，P<0.01)，而非特異性s i R N A組細(xì)胞存活率無(wú)明顯變化(36.00±1.55，P>0.05)。

3 討 論

缺血再灌注損傷激活炎癥反應(yīng)在腦缺血的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10-12]。目前腦缺血再灌注損傷的臨床治療效果仍不十分理想，對(duì)其分子機(jī)制的研究尚待繼續(xù)深入。HMGB1是一種核蛋白，其組成結(jié)構(gòu)可分成兩個(gè)同種異體的HMG 盒，即A 盒和B盒，其活性存在于B盒的前20個(gè)氨基酸序列中[13]。HMGB1主要有兩種來(lái)源：①壞死細(xì)胞被動(dòng)釋放；②免疫細(xì)胞主動(dòng)釋放。目前研究表明，HMGB1作為重要的炎癥介質(zhì)，在腦缺血再灌注損傷中具有十分重要的作用。HMGB1主要與細(xì)胞表面的TLR-2、TLR-4以及RAGE結(jié)合，引起NF-κB的激活與釋放，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)及細(xì)胞死亡[14-15]。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，具有支持、營(yíng)養(yǎng)、信號(hào)傳導(dǎo)等重要作用。以往認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞是腦缺血后主要的炎癥反應(yīng)細(xì)胞[16]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放許多炎癥介質(zhì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在腦缺血的病程中扮演著非常重要的角色[4-5]。

本研究觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧24h后細(xì)胞上清中的HMGB1蛋白濃度明顯升高，隨著氧糖剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，MTT檢測(cè)提示細(xì)胞存活率降低，LDH檢測(cè)提示細(xì)胞LDH漏出率增加，均提示星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷逐漸加重，而HMGB1siRNA組的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷明顯減輕。細(xì)胞損傷情況與HMGB1表達(dá)量密切相關(guān)，RT-PCR和ELISA檢測(cè)HMGB1表達(dá)結(jié)果一致，均提示RNA干擾HMGB1表達(dá)后細(xì)胞損傷程度明顯減輕。Kim等[17]報(bào)道通過(guò)RNA干擾技術(shù)對(duì)SD大鼠進(jìn)行HMGB1基因沉默，可以明顯減少SD大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)后腦梗死體積；Liu等[18]報(bào)道MCAO大鼠腦室內(nèi)注入HMGB1單克隆抗體后，血-腦脊液屏障通透性增高，MMP-9活性降低，梗死區(qū)體積減小，腦缺血后功能恢復(fù)情況改善；Kikuchi等[19]報(bào)道體外給予依達(dá)拉奉可以通過(guò)減少HMGB1的釋放而減輕氧糖剝奪所致的神經(jīng)細(xì)胞死亡；Kikuchi等[20]報(bào)道體外應(yīng)用米諾環(huán)素可抑制HMGB1釋放，進(jìn)而減輕氧糖剝奪所致的PC12細(xì)胞凋亡。本研究應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞的離體腦缺血再灌注損傷模型證實(shí)抑制HMGB1基因表達(dá)可顯著減輕缺血再灌注導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步從離體實(shí)驗(yàn)證實(shí)了HMGB1表達(dá)在腦缺血再灌注損傷中的作用。

HMGB1作為重要的炎癥產(chǎn)物，對(duì)下游的IL-1α/β、TNF-α表達(dá)具有一定調(diào)控激活作用[21]，IL-1α/β、TNF-α等的表達(dá)上調(diào)與細(xì)胞損傷密切相關(guān)，即HMGB1可能扮演對(duì)下游炎癥產(chǎn)物調(diào)節(jié)的開(kāi)關(guān)作用。當(dāng)然，炎癥在腦缺血再灌注損傷中的作用取決于缺血的嚴(yán)重程度以及時(shí)期(早期或晚期)，早期炎癥可能以損害機(jī)體為主，但是晚期炎癥可能對(duì)機(jī)體的修復(fù)有積極作用[22]。Hayakawaa等[8]報(bào)道腦缺血后期星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HMGB1可趨化內(nèi)皮祖細(xì)胞向缺血區(qū)域組織聚集，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)血管單元的重塑，從而對(duì)機(jī)體缺血后的功能恢復(fù)產(chǎn)生有益作用。因此，應(yīng)將研究重點(diǎn)放在如何選擇炎癥干預(yù)的時(shí)間窗以及進(jìn)一步闡明機(jī)體炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制上，從而最大程度的將炎癥的損害作用轉(zhuǎn)化為保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HMGB1在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞缺血再灌注損傷模型中的作用進(jìn)行了探討，而HMGB1以及星形膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)所扮演的角色將在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究和探討。

本研究結(jié)果表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧后可導(dǎo)致細(xì)胞損傷，HMGB1表達(dá)量明顯升高且與細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)；通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)可顯著減輕氧糖剝奪/復(fù)氧導(dǎo)致的細(xì)胞損傷。星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放HMGB1參與腦缺血再灌注損傷的過(guò)程，HMGB1的過(guò)度激活是導(dǎo)致腦缺血再灌注損傷的重要分子機(jī)制。本研究為腦缺血再灌注的臨床治療提供了一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)和一種新思路。

[1]Schulze J, Zierath D, Tanzi P, et al. Severe stroke induces longlasting alterations of high-mobility group box 1[J]. Stroke, 2013,44(1): 246-248.

[2]Huang LF, Yao FH, Dong N, et al. Effects of high mobility group box-1(HMGB1) protein on phenotype of regulatory T cells and functional polarization of T cells in burned rats[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(1): 17-20. [黃立鋒, 姚鳳華, 董寧, 等. 高遷移率族蛋白B1對(duì)燙傷大鼠調(diào)節(jié)性T細(xì)胞表型及T細(xì)胞功能極化的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(1): 17-20.]

[3]Asavarut P, Zhao H, Gu J, et al. The role of HMGB1in inflammation-mediated organ injury[J]. Acta Anaesthesiol Taiwan, 2013, 51(1): 28-33.

[4]Wu X, Liu Y, Chen X, et al. Involvement of TREK-1activity in astrocyte function and neuroprotection under simulated ischemia conditions[J]. J Mol Neurosci, 2013, 49(3): 499-506.

[5]Yamagata K. Pathological alterations of astrocytes in stroke-prone spontaneously hypertensive rats under ischemicconditions[J].Neurochem Int, 2012, 60(1): 91-98.

[6]Wang JP, Qu WS, Zhang Q, et al. Effects of ischemia and anoxia on astrocytic BDNF production in vitro[J]. J Zhengzhou Univ(Med Sci), 2008, 43(3): 480-482.[王建平, 渠文生, 張強(qiáng), 等.王偉缺血缺氧對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成和分泌BDNF的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2008, 43(3): 480-482.]

[7]Skaper SD, Argentini C, Barbierato M. Culture of neonatal rodent microglia, astrocytes, and oligodendrocytes from cortex and spinal cord[J]. Methods Mol Biol, 2012, 846: 67-77.

[8]Hayakawaa K, Phama LD, Katusicb ZS, et al. Astrocytic highmobility group box 1promotes endothelial progenitor cellmediated neurovascular remodeling during stroke recovery[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(19): 7505-7510.

[9]Panickar KS, Polansky MM, Anderson RA. Cinnamon polyphenols attenuate cell swelling and mitochondrial dysfunction following oxygenglucose deprivation in glial cells[J]. Exp Neurol, 2009, 216(2): 420-427.

[10]Raza SS, Khan MM, Ahmad A, et al. Neuroprotective effect of naringenin is mediated through suppression of NF-κB signaling pathway in experimental stroke[J]. Neuroscience, 2013, 230:157-171.

[11]Ito M, Kondo T, Shichita T, et al. Post-ischemic innate immunity and its application for novel therapeutic strategy targeting brain inflammation[J]. Nihon Rinsho, 2013, 71(7): 1291-1301.

[12]Cheng HY, Teng JF, Guo LL. Effect of rhG-CSF on Egr-1and Survivin expressions and vascular regeneration of rats with acute cerebral ischemia reperfusion injury[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2013, 48(2): 200-204. [程鶴云, 滕軍放, 郭利利. 重組人粒細(xì)胞集落刺激因子對(duì)急性缺血再灌注腦損傷大鼠腦組織Egr-1、Survivin蛋白表達(dá)及血管再生的影響[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2013, 48(2): 200-204.]

[13]Stros M, Ozaki T, Bacikova A, et al. HMGB1and HMGB2cellspecifically down-regulate the p53-and p73-dependent sequencespecific tran-sactivation from the human bax gene promoter[J].J Biol Chem, 2002, 277(9): 7157-7164.

[14]Wang L, Zhang X, Liu L, et al. Atorvastatin protects rat brains against permanent focal ischemia and downregulates HMGB1, HMGB1recep-tors(RAGE and TLR4), NF-kappaB expression[J]. Neurosci Lett, 2010, 471(3): 152-156.

[15]Xu CL, Yao YM, Yu Y, et al. Effects of NF-κB inhibitor pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) on mRNA expression of high mobility group box-1protein in organs of rats with endotoxic shock[J]. Med J Chin PLA, 2004, 29(1): 45-47.[胥彩林, 姚詠明, 于燕, 等. NF-κB抑制劑對(duì)內(nèi)毒素休克大鼠高遷移率族蛋白B1表達(dá)的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2004,29(1): 45-47.]

[16]Lai AY, Todd KG. Microgliain cerebral ischemia: molecular actions and interactions[J]. J Can J Physiol Pharmacol, 2006,84(1): 49-59.

[17]Kim ID, Shin JH, Kim SW, et al. Intranasal delivery of HMGB1siRNA confers target gene knockdown and robust neuroprotection in the postischemic Brain[J]. Mol Ther, 2012,20(4): 4829-4839.

[18]Liu K, Mori S, Takahashi HK, et al. Anti-high mobility group box 1monoclonal antibody ameliorates brain infarction induced by transient ischemia in rats[J]. FASEB J, 2007, 21(14): 3904-3916.

[19]Kikuchi K, Kawahara K, Tancharoen S, et al. The free radical scavenger edaravone rescues rats from cerebral infarction by attenuating the release of high-mobility group box-1in neuronal cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2009, 329(3): 865-874.

[20]Kikuchi K, Kawahara K, Biswas KK, et al. Minocycline attenuates both OGD-induced HMGB1release and HMGB1-induced cell death in ischemic neuronal injury in PC12cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 385(2): 132-136.

[21]Naglova H, Bucova M. HMGB1and its physiological and pathological roles[J]. Bratisl Lek Listy, 2012, 113(3): 163-171.

[22]Jin R, Liu L, Zhang S, et al. Role of inflammation and its mediators in acute ischemic stroke[J]. J Cardiovasc Transl Res,2013, 6(5): 834-851.