李敏，甄瑾，朱潤(rùn)秀，梁子紅，崔藍(lán)心，姚遠(yuǎn)

缺血性腦血管病是臨床常見(jiàn)病、多發(fā)病，其發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率及死亡率較高，給患者家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［1-2］。研究表明，腦梗死后的血管再通、局部血流恢復(fù)不僅會(huì)引起血腦屏障（blood brain barrier，BBB）結(jié)構(gòu)及功能破壞，且損傷的BBB也會(huì)再次加重缺血腦組織損傷，形成惡性循環(huán)［3］。既往研究表明，緊密連接相關(guān)蛋白變化將導(dǎo)致BBB功能改變，其中Claudin-5和Occludin是兩個(gè)重要的緊密連接相關(guān)蛋白［4］。ZO-1是與緊密連接相關(guān)蛋白功能相關(guān)的主要胞質(zhì)蛋白，其可以使Claudin-5和Occludin與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架連接，進(jìn)而構(gòu)成跨膜蛋白復(fù)合體［5］?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9可直接降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致BBB破壞，與腦組織損傷密切相關(guān)［6］。研究表明，排斥導(dǎo)向分子（repulsive guidance molecules，RGM）a可通過(guò)細(xì)胞分裂周期蛋白42（cell division cycle protein 42，CDC42）而調(diào)控絲狀偽足，而緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-5水平改變與細(xì)胞骨架蛋白及肌動(dòng)-肌球微細(xì)纖維系統(tǒng)的調(diào)控關(guān)系密切［7］。本研究旨在探究氧糖剝奪影響人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）緊密連接相關(guān)蛋白的機(jī)制，以期為缺血性腦血管病的臨床防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM購(gòu)于Corning公司（貨號(hào)：R10-017-CV），Gibco?胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購(gòu)于Invitrogen（貨號(hào)：16000-044），青霉素-鏈霉素溶液（100×）購(gòu)于Gibco公司（貨號(hào)：15140122），兔抗CDC42抗體（貨號(hào)：ab187643）、兔抗Claudin-5抗體（貨號(hào)：ab131259）、兔抗MMP-9抗體（貨號(hào)：ab38898）、兔抗RGMa抗體（貨號(hào)：ab169761）、兔抗ZO-1抗體（貨號(hào)：ab214228）均購(gòu)于Abcam公司，鼠抗GAPDH抗體購(gòu)于Proteintech公司（貨號(hào)：60004-1-lg），羊抗兔二抗購(gòu)于Beyotime（貨號(hào)：A0208），抗β-actin抗體購(gòu)于Proteintech公司（貨號(hào)：66009-1-Ig），山羊抗鼠二抗購(gòu)于翌圣生物科技（上海）股份有限公司（貨號(hào)：33A212ES60），F(xiàn)luoroshield 封固劑（含DAPI）購(gòu)于Abcam公司（貨號(hào)：ab104139）。實(shí)驗(yàn)儀器：細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于SANYO公司（貨號(hào)：MCO-175），離心機(jī)購(gòu)于Thermo Scientific公司（貨號(hào)：Fresco 21），化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)于Millipore公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)時(shí)間 本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2021年5月至2022年1月。

1.3 氧糖剝奪模型制備 HUVEC來(lái)自上海懿貝瑞生物醫(yī)藥科技有限公司細(xì)胞庫(kù)。在細(xì)胞二氧化碳培養(yǎng)箱中，使用含Gibco?FBS和青霉素-鏈霉素溶液（100×）的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。制備氧糖剝奪模型：將正常培養(yǎng)的HUVEC按3×105個(gè)/孔鋪于6孔板，24 h后生長(zhǎng)密度達(dá)到80%～85%，采用移液槍吸去培養(yǎng)基，加入2 ml 1×PBS清洗1遍，吸掉PBS，換成無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基（含10% FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液），置于缺氧培養(yǎng)箱（向箱室內(nèi)充入95% N2和5% CO2，將氣流自動(dòng)控制為20 L/min，約4 min后箱室被完全充滿，切斷氣體來(lái)源，關(guān)上白色塑料鉗夾以緊閉箱室，最后將箱室置于37 ℃環(huán)境下溫育）培養(yǎng)，制備氧糖剝奪模型；氧糖剝奪后，棄去無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于含1% FBS、1%PBS的DMEM高糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。

1.4 細(xì)胞形態(tài)觀察及細(xì)胞增殖水平檢測(cè) 將HUVEC分為正常組和氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組。正常組HUVEC進(jìn)行正常培養(yǎng)；氧糖剝奪6 h組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h；氧糖剝奪24 h組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察HUVEC的形態(tài)并拍照。然后分別在96孔板中接種3組細(xì)胞懸液（100 μl/孔），向每孔加入10 μl CCK-8溶液孵育，孵育1、2、3、4 d時(shí)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄細(xì)胞增殖水平。

1.5 RGMa敲減質(zhì)粒的構(gòu)建 將shRNA序列（RGMa靶點(diǎn)序列：GTGTGTGGACCAGAAGGTGTA）連接至骨架質(zhì)粒大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10 LV-002（YBR，YBRLV002）載體中，酶切位點(diǎn)1為EcoR 5-'GAATTC-3'，酶切位點(diǎn)2為AgeI 5-'ACCGGT-3'，載體連接使用T4 DNA Ligase（EL0016，F(xiàn)ermentas）完成，質(zhì)粒載體構(gòu)建成功后進(jìn)行測(cè)序分析，如質(zhì)粒序列與預(yù)設(shè)序列一致、測(cè)序結(jié)果為單一峰，則提示該病毒可敲低RGMa。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化與克?。翰捎脽峒し▽①|(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Top10（酶康GTC，GTCBC-G001），平板篩選培養(yǎng)，單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)并提取高純度的質(zhì)粒DNA。

1.6 慢病毒轉(zhuǎn)染 將RGMa敲減質(zhì)粒包裝成慢病毒，準(zhǔn)備HUVEC，復(fù)蘇HUVEC并進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染：慢病毒轉(zhuǎn)染前18～24 h，將貼壁細(xì)胞以1×106個(gè)/孔鋪到6孔板中培養(yǎng)，使細(xì)胞在慢病毒轉(zhuǎn)染時(shí)的數(shù)量為2×106個(gè)/孔左右。第2天用含6 μg/ml polybrene的新鮮培養(yǎng)基2 ml替換原培養(yǎng)基，加入適量病毒懸液，于37 ℃環(huán)境下孵育；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用新鮮培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率達(dá)到80%以上，表明慢病毒轉(zhuǎn)染成功。

1.7 Western blot法檢測(cè)RGMa、緊密連接相關(guān)蛋白、MMP-9、CDC42 將HUVEC分為氧糖剝奪組、空質(zhì)粒組、RGMa質(zhì)粒敲減組。氧糖剝奪組HUVEC制備氧糖剝奪模型，并在缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；空質(zhì)粒組HUVEC在氧糖剝奪組基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染空載體；RGMa質(zhì)粒敲減組HUVEC在氧糖剝奪組基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染慢病毒。然后從培養(yǎng)箱中取出HUVEC，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌1次；棄去PBS，加入細(xì)胞裂解液，置于4 ℃冰上；采用移液槍頭吹打至細(xì)胞充分裂解，將細(xì)胞裂解樣品轉(zhuǎn)移至離心管，冰上繼續(xù)裂解10～15 min；離心（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑10 cm）10 min，取上清液并轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入Loading Buffer（100 ℃，20 min）后再次離心（4 ℃，12 000 r/min，離心半徑10 cm）1 min，于-20 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。行SDSPAGE，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上；加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1 h，加入一抗兔抗CDC42抗體（1∶3 000）、一抗兔抗Claudin-5抗體（1∶1 000）、一抗兔抗MMP-9抗體（1∶1 000）、一抗兔抗RGMa抗體（1∶5 000）、一抗兔抗ZO-1抗體（1∶2 000）及一抗鼠抗GAPDH抗體（1∶30 000），室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，10 min/次；加入辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，10 min/次。使用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，檢測(cè)RGMa、Claudin-5、ZO-1、MMP-9及CDC42。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氧糖剝奪對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 與正常組相比，氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組細(xì)胞體腫脹或變形，光暈消失，細(xì)胞邊緣不清晰，細(xì)胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡，突起縮短，連接斷裂，視野內(nèi)顆粒樣物質(zhì)增多，細(xì)胞變形，見(jiàn)圖1。

圖1 正常組、氧糖剝奪6 h組、氧糖剝奪24 h組細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 1 Cell morphology in the normal group，oxygen glucose deprivation 6 h group and oxygen glucose deprivation 24 h group

2.2 氧糖剝奪對(duì)細(xì)胞增殖水平的影響 孵育1、2、3、4 d，正常組和氧糖剝奪6 h組細(xì)胞增殖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；孵育1、2、3、4 d，氧糖剝奪24 h組細(xì)胞增殖水平均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1～2。

表1 正常組和氧糖剝奪6 h組孵育不同時(shí)間細(xì)胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 6 h group at different time of incubation

表1 正常組和氧糖剝奪6 h組孵育不同時(shí)間細(xì)胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 6 h group at different time of incubation

組別 孵育1 d 孵育2 d 孵育3 d 孵育4 d正常組 1.36±0.01 2.28±0.01 5.42±0.07 10.4±0.03氧糖剝奪6 h組 1.35±0.01 2.30±0.03 5.33±0.04 10.5±0.06 t值 0.71 1.25 1.80 1.90 P值 0.52 0.28 0.15 0.13

表2 正常組和氧糖剝奪24 h組不同時(shí)間細(xì)胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 24 h group at different time of incubation

表2 正常組和氧糖剝奪24 h組不同時(shí)間細(xì)胞增殖水平比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of cell proliferation levels between normal group and oxygen glucose deprivation 24 h group at different time of incubation

組別 孵育1 d 孵育2 d 孵育3 d 孵育4 d正常組 1.36±0.01 2.28±0.01 5.42±0.07 10.40±0.03氧糖剝奪24 h組 1.00±0.00 1.00±0.01 1.30±0.01 1.50±0.02 t值 49.94 141.40 98.61 394.80 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

2.3 RGMa質(zhì)粒敲減對(duì)RGMa、緊密連接相關(guān)蛋白、MMP-9、CDC42的影響 氧糖剝奪組、空質(zhì)粒組、RGMa質(zhì)粒敲減組RGMa、Claudin-5、ZO-1、MMP-9、CDC42比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；氧糖剝奪組和空質(zhì)粒組RGMa、Claudin-5、CDC42比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；空質(zhì)粒組ZO-1、MMP-9低于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；RGMa質(zhì)粒敲減組RGMa、ZO-1、CDC42低于氧糖剝奪組，Claudin-5、MMP-9高于氧糖剝奪組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 氧糖剝奪組、空質(zhì)粒組、RGMa質(zhì)粒敲減組RGMa、緊密連接相關(guān)蛋白、MMP-9、CDC42比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of RGMa，tight junction-related protein，MMP-9 and CDC42 in the oxygen glucose deprivation group，empty plasmid group，RGMa plasmid knockdown group

表3 氧糖剝奪組、空質(zhì)粒組、RGMa質(zhì)粒敲減組RGMa、緊密連接相關(guān)蛋白、MMP-9、CDC42比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of RGMa，tight junction-related protein，MMP-9 and CDC42 in the oxygen glucose deprivation group，empty plasmid group，RGMa plasmid knockdown group

注：RGM=排斥導(dǎo)向分子，MMP=基質(zhì)金屬蛋白酶，CDC42=細(xì)胞分裂周期蛋白42；a表示與氧糖剝奪組比較，P＜0.05

組別 RGMa Claudin-5 ZO-1 MMP-9 CDC42氧糖剝奪組 0.84±0.03 0.63±0.03 0.51±0.03 0.59±0.02 0.85±0.07空質(zhì)粒組 0.76±0.05 0.55±0.01 0.25±0.05a0.40±0.03a 0.81±0.35 RGMa質(zhì)粒敲減組 0.65±0.01a0.79±0.12a0.29±0.02a0.75±0.03a 0.45±0.09a F值 23.40 8.73 125.59 46.42 28.19 P值 ＜0.01 0.02 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

3 討論

在發(fā)達(dá)國(guó)家，缺血性腦卒中是僅次于癌癥和心臟病的第三大死亡原因，腦缺血/再灌注導(dǎo)致細(xì)胞損傷的機(jī)制比較復(fù)雜。腦血管內(nèi)皮細(xì)胞及其之間的緊密連接、基底膜、周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞是BBB的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，BBB的結(jié)構(gòu)和功能完整性是維持大腦內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要保障［8］。近年越來(lái)越多的證據(jù)表明，BBB功能障礙和內(nèi)皮細(xì)胞炎癥參與了腦缺血/再灌注損傷的病理過(guò)程［9］。BBB功能障礙使大量炎癥因子如腫瘤壞死因子α、腫瘤壞死因子β、白介素1、白介素6及其他有害物質(zhì)進(jìn)入大腦，進(jìn)而加重腦損傷［3］；而維持BBB的完整性是保護(hù)大腦免受腦缺血損傷的關(guān)鍵措施。目前，腦缺血/再灌注損傷后BBB功能障礙的分子機(jī)制尚不清楚。血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接是維持血管通透性和機(jī)械屏障的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，胞質(zhì)附著蛋白家族中ZO-1和跨膜蛋白Occludin、Claudin-5是BBB緊密連接的主要組分，也是研究BBB結(jié)構(gòu)及功能變化的重要指標(biāo)。

HUVEC是一種具有完整內(nèi)皮屏障功能的人源內(nèi)皮細(xì)胞，是研究BBB功能的一種理想的內(nèi)皮細(xì)胞模型［10］。因此，本研究采用HUVEC構(gòu)建氧糖剝奪模型，結(jié)果顯示，孵育1、2、3、4 d，正常組和氧糖剝奪6 h組細(xì)胞增殖水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但氧糖剝奪24 h組細(xì)胞增殖水平均低于正常組，且氧糖剝奪24 h組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變，提示氧糖剝奪24 h模擬腦缺血缺氧效果較好。

在成年神經(jīng)系統(tǒng)中RGMs具有多種生物學(xué)活性，其可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞形態(tài)和免疫系統(tǒng)、抑制新生血管形成及調(diào)控BBB通透性、多種肌動(dòng)蛋白運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞骨架重組等細(xì)胞生理代謝過(guò)程［11］。此外，RGMa作為一種新的軸突分子，其主要作用是調(diào)控神經(jīng)元的分化、增殖等［12］。研究表明，RGMa可以通過(guò)Rho激酶和GSK-3β信號(hào)通路而使腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2（collapsin response mediator protein 2，CRMP-2）磷酸化，進(jìn)而抑制軸突生長(zhǎng)［13］。Rho激酶和CDC42均屬于Ras超家族成員，其中CDC42能結(jié)合鳥嘌呤三核苷酸，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮著“分子開(kāi)關(guān)”樣的重要作用，且對(duì)細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化具有重要調(diào)節(jié)作用［14］。血管內(nèi)皮之間緊密連接相關(guān)蛋白發(fā)生改變可引起B(yǎng)BB的結(jié)構(gòu)變化，而RGMa可以通過(guò)RhoA或CDC42而影響B(tài)BB的緊密連接［15］。既往實(shí)驗(yàn)表明，腺病毒載體誘導(dǎo)的RGMa沉默可減輕大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注大鼠BBB功能障礙［9］。RGMa及其受體Neogenin在大鼠腦缺血/再灌注損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元及血管內(nèi)皮上表達(dá)，可影響梗死灶周圍皮質(zhì)血管再生［16］。BBB的完整性可由緊密連接相關(guān)蛋白維持，而Claudin-5和ZO-1在封閉緊密連接和維持BBB完整性方面起著至關(guān)重要的作用，缺血損傷可導(dǎo)致Claudin-5和ZO-1明顯減少［17］。MMP是體內(nèi)重要的細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，既往研究表明，在缺血性腦組織中MMP-9表達(dá)增加及活性增強(qiáng)，并通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)而提高BBB的通透性［18］。鑒于Claudin-5、ZO-1及MMP-9在影響B(tài)BB通透性中的關(guān)鍵作用，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建RGMa敲減質(zhì)粒，并將其包裝成慢病毒后轉(zhuǎn)染HUVEC，結(jié)果顯示，RGMa質(zhì)粒敲減組RGMa、ZO-1、CDC42低于氧糖剝奪組，Claudin-5高于氧糖剝奪組，提示RGMa質(zhì)粒敲減后CDC42和ZO-1表達(dá)下調(diào)，Claudin-5表達(dá)上調(diào)，推測(cè)氧糖剝奪引起HUVEC緊密連接相關(guān)蛋白改變的機(jī)制可能與RGMa影響CDC42蛋白有關(guān)。既往研究顯示，缺血損傷可導(dǎo)致Claudin-5明顯減少［17］，而本研究結(jié)果顯示氧糖剝奪可導(dǎo)致Claudin-5表達(dá)上調(diào)，分析原因可能與RGMa干預(yù)或CDC42有關(guān)，仍需要?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究結(jié)果還顯示，空質(zhì)粒組MMP-9低于氧糖剝奪組，RGMa質(zhì)粒敲減組MMP-9高于氧糖剝奪，提示MMP-9降低與轉(zhuǎn)染空載體有關(guān)。

綜上所述，氧糖剝奪24 h可引起HUVEC增殖水平降低，氧糖剝奪引起HUVEC緊密連接相關(guān)蛋白改變的機(jī)制可能為RGMa通過(guò)CDC42而影響B(tài)BB的緊密連接，這對(duì)于探究腦缺血損傷患者BBB功能障礙機(jī)制具有重要意義。

作者貢獻(xiàn)：姚遠(yuǎn)進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；李敏、梁子紅進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析；李敏、甄瑾、梁子紅、崔藍(lán)心進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；甄瑾、朱潤(rùn)秀進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；李敏、姚遠(yuǎn)負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文。

本文無(wú)利益沖突。