賈超，張劉珍，邢爽，柳曉蘭，善亞君，叢悅，崔宇，王麗梅，從玉文

骨髓內造血干/祖細胞受到外界刺激后可迅速釋放到外周血中[1]。急性放射病時骨髓造血功能障礙，造血干/祖細胞數(shù)量顯著減少[2]，但殘存的造血干/祖細胞功能尚未完全損傷，保護照射后骨髓殘存造血干/祖細胞可以促進自身造血功能的重建。維生素E衍生物α-生育酚琥珀酸酯(α-tocopherol succinate，α-TOS)具有獨特的藥理保健功能及免疫調節(jié)和細胞保護作用[3]，且其抗氧化作用強于生育酚[4]。研究顯示，在照射前24h皮下注射400mg/kg α-TOS對經(jīng)致死劑量照射的CD2F1小鼠具有明顯的保護作用[5]，但α-TOS對射線照射后早期造血干/祖細胞的影響鮮有報道。本研究觀察了α-TOS對60Co γ射線照射C57BL/6J雄性小鼠早期造血功能的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 D-α-生育酚琥珀酸酯(C33H54O5)購于美國Sigma公司，批號SL10043，1210U/g，以4%的DMSO完全溶解后，用聚乙二醇(PEG400)配成8.8mg/ml的溶液。MEK-7222K全自動血細胞分析儀(日本光電工業(yè)株式會社公司)，F(xiàn)ACSVerse流式細胞儀(美國BD公司)，MEK-640外周血象檢測稀釋液(日本光電工業(yè)株式會社公司)；IMDM培養(yǎng)基(Gibco，上海立菲生物技術公司)，甲基纖維素培養(yǎng)基(StemCell，Methocult M3434)。

1.2 實驗動物及分組 實驗采用6～8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠，體重22±2g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物質量合格證證號SCXK(京)-2009-0004。購回后在軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心飼養(yǎng)，動物飼養(yǎng)設施合格證號SYXK-(軍) 2007-004。照射前1周將實驗動物分籠飼養(yǎng)于SPF級動物房(每籠5只)，自由飲水，標準飼料經(jīng)60Co γ射照射除菌后喂養(yǎng)。照射前24h將實驗動物稱重并隨機分組，α-TOS組小鼠皮下注射400mg/kg α-TOS (0.1ml/只)，正常對照和照射對照組小鼠皮下注射輔劑PEG4000.1ml/只。競爭抑制實驗中，綠色熒光蛋白(EGFP)轉基因小鼠由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心贈送，并于該中心飼養(yǎng)。

1.3 動物照射 將實驗動物放入有機玻璃盒內行鈷源照射，照射距離4.5m，一次全身照射不同劑量，照射量率67～69cGy/min。照射后小鼠送回動物房飼養(yǎng)，每日觀察。

1.4 存活實驗 20只小鼠稱重后隨機分成照射對照組和α-TOS組(n=10)，兩組照射劑量均為9.0Gy，照射量率68.5cGy/min。照射后連續(xù)30d觀察動物存活數(shù)，繪制存活曲線。

1.5 外周血象檢測 30只小鼠隨機分為正常對照組、照射對照組和α-TOS組(n=10)。照射對照組和α-TOS組小鼠接受一次性6.5Gy全身照射，照射量率67.1cGy/min。給藥前1h從每只小鼠尾靜脈取血20μl，快速吹打進裝有2ml外周血象檢測稀釋液的EP管中，采用全自動血細胞分析儀檢測血象，作為0d的數(shù)據(jù)，照射后1、4、7、10、14、18、22、31、45d割尾取血檢測外周血象。

1.6 骨髓有核細胞(BMNCs)計數(shù) 12只小鼠隨機分成正常對照組、照射對照組和α-TOS組(n=4)。照射對照組和α-TOS組小鼠接受一次性6.5Gy全身照射，照射量率68.0cGy/min。照射后2h、24h脫臼處死動物，75%乙醇浸泡消毒，剝取小鼠股骨，剔除股骨肌肉，用2%FBS IMDM緩沖液、7號針頭沖出骨髓，過4號針頭制成骨髓單細胞懸液，吹打均勻，細胞計數(shù)板計數(shù)BMNCs數(shù)量。

1.7 骨髓細胞集落培養(yǎng) 將1.6獲取的BMNCs加入甲基纖維素培養(yǎng)基，調整細胞密度為5×104/ml，然后接種于12孔培養(yǎng)板，1ml/孔，每組3只復孔，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第4天計數(shù)紅細胞集落生成單位(CFU-E，大于8個細胞/集落)，第7天分別計數(shù)粒細胞-單核細胞集落生成單位(CFU-GM，大于50個細胞/集落)、爆式紅系集落生成單位(BFU-E，大于50個細胞/集落)、巨核細胞集落形成單位(CFU-MK，大于3個細胞/集落)、混合集落生成單位(CFU-Mix，含有粒、紅、巨噬和巨核多個造血細胞系列的集落)。計數(shù)紅系BFU-E時，需進行二甲氧基聯(lián)苯胺染色，集落細胞呈棕紅色者為陽性。

1.8 骨髓競爭移植實驗 供體小鼠一：C57BL/6J小鼠分為正常對照供體、照射對照供體和α-TOS給藥供體3組，每組4只，按1.2方式給藥，照射對照組和α-TOS給藥組供體一次性全身照射6.5Gy，照射量率67.3cGy/min。照射后2h取股骨沖出骨髓單細胞，計數(shù)后重懸細胞，調整密度至2×107/ml。供體小鼠二：EGFP轉基因小鼠4只，取股骨沖出骨髓單細胞，計數(shù)后重懸細胞，調整密度至2×106個/ml。將供體小鼠一的3組小鼠骨髓細胞懸液分別與供體小鼠二的骨髓細胞懸液等體積混合，細胞數(shù)量比例為10:1。

受體小鼠：C57BL/6J小鼠30只，一次性全身照射9.0Gy，照射量率67.3cGy/min。照射后6h隨機分為3組，每組10只動物，分別接受上述混合BMNCs經(jīng)尾靜脈注射移植后分為正常對照組、照射對照組和α-TOS組。受體鼠接受來自C57BL/6J小鼠的移植細胞數(shù)為2×106個/只，來自EGFP轉基因小鼠的移植細胞數(shù)為2×105個/只。移植后35d各受體鼠割尾取血，流式細胞儀檢測EGFP陽性細胞的比例。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)結果以x±s表示，采用Origin Pro8軟件包進行作圖。存活實驗中兩樣本的比較采用獨立樣本t檢驗；其他實驗多個樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，外周血細胞數(shù)據(jù)的比較采用重復測量的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 α-TOS對9.0Gy照射小鼠存活率的影響 照射對照組小鼠照射后第9天開始出現(xiàn)死亡，第13天全部死亡，存活時間為10±1d(圖1)。α-TOS組小鼠從照射后第12天開始出現(xiàn)死亡，30d小鼠存活率為40%，死亡鼠存活時間15±6d。與照射對照組比較，α-TOS可明顯提高9.0Gy照射小鼠30d存活率，并顯著延長死亡動物存活時間(P<0.01)。照射前24h皮下給予400mg/kg α-TOS后小鼠未出現(xiàn)明顯不良反應。

圖1 α-TOS對9.0Gy γ射線照射小鼠存活率的影響Fig. 1Effect of α-TOS on survival rate of 9.0Gy γ-ray irradiated mice

圖2 α-TOS對6.5Gy γ射線照射小鼠外周血象的影響Fig. 2Effect of α-TOS on peripheral blood cells in mice irradiated with 6.5Gy γ-ray

2.2 α-TOS對6.5Gy照射小鼠外周血象的影響 照射后1d小鼠外周血白細胞數(shù)(WBC)急劇下降，第4天達最低值，隨后開始恢復，但回升緩慢，第10天仍維持較低水平，而α-TOS組回升迅速，照射后第10、14、18、31天明顯高于照射對照組(P<0.01)，31d基本恢復至正常水平(圖2A)。照射后1d小鼠外周血中性粒細胞(NEUT)即開始下降，第4天達最低值，隨后開始恢復，α-TOS組照射后第7、10、14、18天明顯高于照射對照組(P<0.05，P<0.01，P<0.001，圖2B)。照射對照組小鼠外周血紅細胞(RBC)呈進行性下降，第18天達最低值，隨后開始恢復；α-TOS組小鼠外周血RBC在照射后第4天高于照射對照組(P<0.05)，第10天開始恢復，恢復開始時間明顯早于照射對照組，且明顯提高了最低值水平(P<0.05)，照射后第14、18、22、31天外周血RBC均明顯高于照射對照組(圖2C)。照射對照組小鼠外周血小板(PLT)在照射后快速下降(圖2D)，第10天達最低值，α-TOS組小鼠第10、14、18天均明顯高于照射對照組(P<0.01)。

2.3 α-TOS對6.5Gy照射小鼠照射后2h骨髓造血祖細胞的影響 6.5Gy照射后2h小鼠BMNCs總數(shù)無明顯變化(表1)。圖3反映了小鼠受照后2h骨髓造血祖細胞數(shù)目和集落生成能力，與照射對照組比較，α-TOS組集落形成數(shù)無明顯升高，通過CFCs及MPCs計算小鼠每根股骨中有增殖能力的造血祖細胞數(shù)目，結果顯示α-TOS組的粒-巨噬系祖細胞、巨核系祖細胞、多向系祖細胞數(shù)均明顯低于照射對照組(P<0.05，P<0.01)。

2.4 α-TOS對小鼠受照射后24h骨髓造血祖細胞的影響 照射后24h，受照射小鼠BMNCs明顯減少，照射對照組與α-TOS組比較無明顯差異(表1)。小鼠骨髓造血祖細胞數(shù)目和集落生成能力如圖4所示，與照射對照組比較，α-TOS組各系集落數(shù)均有明顯升高(P<0.01)，紅系各期祖細胞、粒-巨噬系祖細胞、巨核系祖細胞、多向系祖細胞數(shù)均高于照射對照組(P<0.01，P<0.05)。

表1 小鼠受照射后2h、24h BMNCs計數(shù)(×106/股骨，，n=4)Tab. 1Number of mice bone marrow nucleated cells at 2and 24hours after irradiation(×106per femur,, n=4)

表1 小鼠受照射后2h、24h BMNCs計數(shù)(×106/股骨，，n=4)Tab. 1Number of mice bone marrow nucleated cells at 2and 24hours after irradiation(×106per femur,, n=4)

(1)P<0.001compared with normal group

Group 2h 24h Normal 20.0±4.7 45.6±8.2Irradiation 22.0±5.8 9.4±1.4(1)α-TOS 18.1±7.8 6.9±2.4(1)F 0.3915 75.09P 0.6870 <0.001

圖3 α-TOS對6.5Gy γ射線照射后2h小鼠骨髓造血祖細胞的影響Fig. 3Effects of α-TOS on bone marrow progenitor cells in mice at 2hours after 6.5Gy γ-ray irradiation

圖4 α-TOS對6.5Gy γ射線照射后24h小鼠骨髓造血祖細胞的影響Fig. 4Effects of α-TOS on bone marrow progenitor cells in mice at 24hours after 6.5Gy γ-ray irradiation

2.5 α-TOS對受照小鼠骨髓造血干細胞的影響將各供體組與正常EGFP小鼠的骨髓細胞混合移植后35d，檢測各受體組小鼠外周血中EGFP陽性細胞比例(圖5)。正常對照組小鼠中，EGFP比例接近0，說明在造血重建過程中，來自正常小鼠C57BL/6J的骨髓細胞與來自EGFP小鼠的骨髓細胞相比具有絕對優(yōu)勢。而接受照射的小鼠骨髓細胞與來自EGFP小鼠的骨髓細胞按10:1比例共輸注后，EGFP小鼠骨髓細胞承擔了主要的造血重建功能，與照射對照組比較，α-TOS受體組小鼠EGPF陽性細胞比例明顯下降(80.11% vs 85.65%，P<0.01)，即來自α-TOS供體組的小鼠干細胞發(fā)揮了較好的作用，說明α-TOS明顯保護了受照射小鼠骨髓干細胞的活性和能力。

3 討 論

骨髓中有核細胞以粒細胞系統(tǒng)、紅細胞系統(tǒng)和淋巴細胞系統(tǒng)為主，還有少量單核細胞、巨核細胞和其他一些骨髓細胞，并且各系統(tǒng)血細胞中的原始階段細胞極少，以成熟階段細胞為主。輻照損傷后，骨髓有核細胞總數(shù)減少，紅系細胞比例大幅下降。造血祖細胞是造血干細胞分化成骨髓造血原始細胞之前的中間發(fā)育階段，雖然其增殖能力有限，但對造血損傷后血細胞減少階段和恢復期的造血重建具有重要意義，其數(shù)量的維持依賴于造血干細胞的增殖分化[6]。造血干細胞是輻射損傷后造血功能重建的基礎，造血干細胞死亡或增殖能力喪失，使血細胞生成夭折于起始階段是照后全血細胞減少的重要原因，如果受照射的造血干細胞殘存并保留部分增殖分裂能力，則具有迅速恢復的潛能。

圖5 α-TOS對6.5Gy γ射線照射后2h小鼠骨髓干細胞的影響Fig. 5Effects of α-TOS on bone marrow stem cells in mice at 2hours after 6.5Gy γ-ray irradiation

本研究結果表明，維生素E的衍生物α-TOS可有效提高9.5Gy致死劑量照射小鼠的存活率，延長存活時間，并可促進6.5Gy照射小鼠外周血WBC、NEUT、RBC和PLT的恢復。在探討α-TOS對小鼠受照射后早期造血干/祖細胞的影響時，集落培養(yǎng)結果和造血祖細胞計數(shù)顯示，照射對照組各系造血祖細胞數(shù)量從2h開始急劇下降，24h繼續(xù)降低，說明照射對造血祖細胞早期的損傷比較嚴重。α-TOS組各系造血祖細胞數(shù)量2h時亦明顯降低，照射后24h紅系祖細胞和爆式紅系祖細胞數(shù)繼續(xù)降低，但降低幅度小于照射對照組，而粒-巨噬系祖細胞、巨核系祖細胞、多向系祖細胞數(shù)量則開始回升，明顯高于照射對照組，提示照射后2h α-TOS沒有表現(xiàn)出對照射小鼠造血祖細胞的保護作用，而24h則有明顯保護效果。競爭性移植實驗結果顯示，照射后2h，來自α-TOS供體組的干細胞具有更強的重建能力，表明α-TOS保護了受照射小鼠早期骨髓干細胞的活性和功能。上述結果表明，α-TOS對受照射小鼠早期造血干/祖細胞具有明顯的保護作用，進而減輕了急性放射病小鼠早期造血損傷的程度，加速外周血細胞數(shù)量的恢復，最終達到降低致死效應的目的。

在集落形成實驗中，α-TOS組照射后2h部分系造血祖細胞數(shù)量明顯低于照射對照組，推測可能是由于α-TOS的動員作用所致。文獻報道α-TOS[7]以及另一種維生素E類化合物γ-生育三烯酚[8-9]均有動員小鼠骨髓干/祖細胞進入外周血的能力，因此，照射后2h骨髓腔中的造血祖細胞數(shù)量一過性降低可能與其被動員入血有關。另有報道認為α-TOS可誘導粒細胞集落刺激因子(G-CSF)生成，繼而由G-CSF動員干細胞進入外周血[10]。但α-TOS對受輻射小鼠照后早期造血干/祖細胞的保護作用是細胞直接動員效應還是刺激細胞因子分泌產生的間接效應目前尚不明確，有待進一步深入研究。

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