張丹 馮流星 王軍 熊金平
摘要 建立了高效液相色譜(HPLC)與電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPMS)聯(lián)用,同時結合柱后同位素稀釋法,通過直接測定硫及鐵元素,實現(xiàn)蛋白質(zhì)絕對定量的分析方法。選取分子量不同的4種標準蛋白:轉鐵蛋白、β乳球蛋白、肌紅蛋白和溶菌酶作為混合蛋白,34S或54Fe同位素稀釋劑與液相色譜洗脫液經(jīng)三通混合后,在線進入ICPMS檢測。根據(jù)同位素稀釋法公式及蛋白中硫、鐵的含量計算混合蛋白中每種蛋白的濃度,與天平稱量結果一致,對方法進行了驗證。將方法應用到人血清轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析,針對兩種蛋白含量差別大導致的信號差異,通過改變同位素稀釋劑的流速,成功測定了人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的含量。采用34S及54Fe同位素稀釋劑分別定量的血清中轉鐵蛋白濃度為(2.35±0.01)g/L和(2.22±0.13)g/L,結果基本吻合。方法精密度RSD均小于10%,可用于基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的定量分析。
關鍵詞 同位素稀釋; 蛋白質(zhì)定量; 電感耦合等離子體質(zhì)譜; 轉鐵蛋白; 白蛋白
1引言
蛋白質(zhì)組學的快速發(fā)展,不但需要準確鑒定蛋白質(zhì),還要求對處于動態(tài)變化的蛋白質(zhì)進行定量分析[1~4]。目前比較成熟的定量方法多是基于穩(wěn)定同位素標記的生物質(zhì)譜[5,6],但是生物質(zhì)譜的信號響應與蛋白質(zhì)或肽段含量間的關系十分復雜,沒有蛋白質(zhì)標準作歸一化處理,很難對蛋白質(zhì)或肽段定量。與生物質(zhì)譜不同,電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICPMS)分析中元素的響應與原子所處的分子環(huán)境無關[7],而且樣品處理簡單,易于色譜聯(lián)用,可進行同位素分析[8]。因此,利用ICPMS對蛋白質(zhì)中的元素定量分析,是近年來蛋白質(zhì)定量技術研究的熱點。硫是最適合作為蛋白質(zhì)定量分析的元素[9]。根據(jù)SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計分析,分別有96.6%、98.8%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[10]。如果蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知,就能確定其中的硫原子數(shù);那么通過ICPMS測定硫的含量來實現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量是完全可行的[11]。但是,目前ICPMS直接測定硫來定量的蛋白,主要是標準蛋白,涉及基體樣品的很少,因為ICPMS測量硫存在一些困難:需使用碰撞池技術或高分辨ICPMS克服O+2對硫的譜線干擾[12]。常見的ICPMS對蛋白質(zhì)定量研究集中在金屬蛋白上[13,14],定量原理與含硫蛋白相同。
為保證定量分析的準確度,需使用與待測蛋白匹配的標準物質(zhì)來保障質(zhì)控與量傳,但由于蛋白質(zhì)種類繁多、結構復雜,目前可獲得的蛋白標準十分匱乏。同位素稀釋法(ID)是國際公認的具有權威性化學計量方法,只需硫或金屬的濃縮同位素即可實現(xiàn)不同基體蛋白的定量分析[15]。
高效液相色譜(HPLC)的同位素稀釋法分為特異性、非特異性形態(tài)[16]。前者在前處理時就將稀釋劑加入到樣品中,具有傳統(tǒng)同位素稀釋法的優(yōu)點;但是必須開發(fā)針對目標蛋白的特異性稀釋劑制備方法,目前商品化或人工合成的稀釋劑非常有限,直到2005年才有文獻報道第一次應用到蛋白質(zhì)的定量分析[17]。而非特異性形態(tài)同位素稀釋(也稱柱后同位素稀釋)對蛋白質(zhì)的種類、結構沒有要求,同位素稀釋劑常為某元素的簡單離子,基本都有商品化的產(chǎn)品,適合于蛋白質(zhì)的定量分析。
目前,文獻報道了高效液相色譜柱后同位素稀釋質(zhì)譜法(HPLCIDICPMS), 通過測硫定量標準蛋白[11]和測鐵定量轉鐵蛋白[14],但是未見對硫、鐵共同定量蛋白的比較及人血清中多種蛋白的定量。本研究采用液相色譜分離混合蛋白,ICPMS測硫、鐵分別定量的標準蛋白結果與天平稱量結果比較,驗證了HPLCIDICPMS方法,并對硫、鐵定量分析進行比較。在此基礎上,將方法應用到人血清中轉鐵蛋白、白蛋白的定量分析,測定了血清中兩種蛋白的含量。本方法體系可應用在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、臨床檢驗的化學計量、相關實驗室認證等生命科學研究的重要領域,促進我國生命科學測量水平的不斷提高和測量溯源性研究的深入發(fā)展。
2實驗部分
2.1儀器、試劑與樣品
Element 2扇形磁場電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國ThermoFisher Scientific公司);高效液相色譜系統(tǒng)(日本Shimadzu公司):含LC30AD泵、LC20AD泵、SIL30AC自動進樣器、CTO20A柱溫箱、SPD20A紫外檢測器;Toledo型電子天平(瑞士Mettler公司);MillQ超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司);TSKGel G3000SWxl凝膠柱(300 mm×7.8 mm,日本Tosoh公司);Shodex QA825 IEC色譜柱(75 mm×8.0 mm, 日本Shodex公司)
Tris、人血清轉鐵蛋白Transferrin(Tf,75.2 kDa,每分子含47個S原子)、白蛋白Albumin(Alb,66.4 kDa,含41個S原子)、牛β乳球蛋白Lactoglobulin(Lacb,18.36 kDa,含9個S原子)、雞溶菌酶Lysozyme(Lys,14.31 kDa,含12個S原子),均購自Sigma公司;甲酸銨、乙酸銨,購于Fisher Scientific公司;馬心肌紅蛋白Myoglobin(Myo,16.95 kDa,含3個S原子)、人血清樣品來自中國計量科學研究院;其它試劑均為國產(chǎn)分析純;實驗用水為超純水(18.2 MΩ·cm)。
4種標準蛋白Tf, Lacb, Myo和 Lys用天平準確稱量后混合,溶于超純水中備用;人血清樣品不經(jīng)任何處理,直接進入液相色譜進行分析。
34S濃縮同位素(美國橡樹嶺實驗室):同位素32S/34S豐度比為0.01417;54Fe濃縮同位素(中國計量科學研究院):同位素56Fe/54Fe豐度比為0.11313。
2.2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀條件
儀器工作參數(shù)為:功率 1300 W,樣品氣流速1.05 L/min,輔助氣流速0.87 L/min,冷卻氣流速16.0 L/min, 分辨率(m/Δm) 4000;掃描次數(shù) 700×1。
2.3高效液相色譜分離條件
2.3.1尺寸排阻色譜(SEC)分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽(如NaCl等)在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量;文獻[18]研究發(fā)現(xiàn),0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果,又不會引入高濃度鹽;而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液,流速為0.4 mL/min, 紫外檢測器波長280 nm,分析時間40 min,等度洗脫。
2.3.2陰離子交換色譜(IEC)分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近,尺寸排阻色譜柱分離人血清時,兩者的保留時間重合,不能達到分離效果,因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相: 0.02 mol/L TrisHCl(pH 8.6); B相: A+0.5 mol/L甲酸銨溶液,流速為0.7 mL/min, 時間程序: 0~30 min, 0~100% B; 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。
2.4HPLCIDICPMS分析
柱后同位素稀釋時,稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入,與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離,ICPMS檢測對蛋白定量分析。
質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖,根據(jù)同位素稀釋公式(1),轉化為元素的質(zhì)量流(Mass flow)譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量,依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù),就可計算出蛋白的絕對濃度。
MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs(Rm-Rsp)(Rs-Rm)(1)
式中, csp, dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min); Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量; Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度; Rm, Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。
血清中目標蛋白的正常含量范圍不同:轉鐵蛋白2.35~3.00 g/L,白蛋白35~50 g/L;導致兩種蛋白中硫含量差別很大,為保證Rm比值合適,采用改變稀釋劑流速的方法,在液相時間程序的前15 min(轉鐵蛋白出峰部分),34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min;之后白蛋白出峰時間段,流速提高到0.2 mL/min。[TS(][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖
Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS)]
3結果與討論
3.1含硫標準蛋白的絕對定量
尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白(Tf, Lacb, Myo和Lys)的譜圖如圖1所示, 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來,Tf, Lacb, Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9, 23.9, 26.3和29.9 min。
2.3高效液相色譜分離條件
2.3.1尺寸排阻色譜(SEC)分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽(如NaCl等)在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量;文獻[18]研究發(fā)現(xiàn),0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果,又不會引入高濃度鹽;而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液,流速為0.4 mL/min, 紫外檢測器波長280 nm,分析時間40 min,等度洗脫。
2.3.2陰離子交換色譜(IEC)分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近,尺寸排阻色譜柱分離人血清時,兩者的保留時間重合,不能達到分離效果,因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相: 0.02 mol/L TrisHCl(pH 8.6); B相: A+0.5 mol/L甲酸銨溶液,流速為0.7 mL/min, 時間程序: 0~30 min, 0~100% B; 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。
2.4HPLCIDICPMS分析
柱后同位素稀釋時,稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入,與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離,ICPMS檢測對蛋白定量分析。
質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖,根據(jù)同位素稀釋公式(1),轉化為元素的質(zhì)量流(Mass flow)譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量,依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù),就可計算出蛋白的絕對濃度。
MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs(Rm-Rsp)(Rs-Rm)(1)
式中, csp, dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min); Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量; Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度; Rm, Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。
血清中目標蛋白的正常含量范圍不同:轉鐵蛋白2.35~3.00 g/L,白蛋白35~50 g/L;導致兩種蛋白中硫含量差別很大,為保證Rm比值合適,采用改變稀釋劑流速的方法,在液相時間程序的前15 min(轉鐵蛋白出峰部分),34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min;之后白蛋白出峰時間段,流速提高到0.2 mL/min。[TS(][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖
Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS)]
3結果與討論
3.1含硫標準蛋白的絕對定量
尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白(Tf, Lacb, Myo和Lys)的譜圖如圖1所示, 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來,Tf, Lacb, Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9, 23.9, 26.3和29.9 min。
2.3高效液相色譜分離條件
2.3.1尺寸排阻色譜(SEC)分離混合標準蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動相中高濃度鹽(如NaCl等)在質(zhì)譜錐上的堆積會影響ICPMS測量;文獻[18]研究發(fā)現(xiàn),0.2 mol/L乙酸銨作為流動相時既能保證分離效果,又不會引入高濃度鹽;而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h,沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實驗所用的流動相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液,流速為0.4 mL/min, 紫外檢測器波長280 nm,分析時間40 min,等度洗脫。
2.3.2陰離子交換色譜(IEC)分離人血清由于轉鐵蛋白與白蛋白分子量接近,尺寸排阻色譜柱分離人血清時,兩者的保留時間重合,不能達到分離效果,因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相: 0.02 mol/L TrisHCl(pH 8.6); B相: A+0.5 mol/L甲酸銨溶液,流速為0.7 mL/min, 時間程序: 0~30 min, 0~100% B; 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。
2.4HPLCIDICPMS分析
柱后同位素稀釋時,稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入,與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進入ICPMS檢測。液相色譜實現(xiàn)混合蛋白分離,ICPMS檢測對蛋白定量分析。
質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖,根據(jù)同位素稀釋公式(1),轉化為元素的質(zhì)量流(Mass flow)譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應蛋白中該元素的絕對含量,依據(jù)液相進樣體積及蛋白所含元素個數(shù),就可計算出蛋白的絕對濃度。
MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs(Rm-Rsp)(Rs-Rm)(1)
式中, csp, dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度(ng/g)、密度(g/mL)和流速(mL/min); Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量; Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度; Rm, Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。
血清中目標蛋白的正常含量范圍不同:轉鐵蛋白2.35~3.00 g/L,白蛋白35~50 g/L;導致兩種蛋白中硫含量差別很大,為保證Rm比值合適,采用改變稀釋劑流速的方法,在液相時間程序的前15 min(轉鐵蛋白出峰部分),34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min;之后白蛋白出峰時間段,流速提高到0.2 mL/min。[TS(][HT5”SS]圖14種混合標準蛋白的液相色譜圖
Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS)]
3結果與討論
3.1含硫標準蛋白的絕對定量
尺寸排阻液相色譜分離4種混合標準蛋白(Tf, Lacb, Myo和Lys)的譜圖如圖1所示, 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來,Tf, Lacb, Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時間分別為21.9, 23.9, 26.3和29.9 min。