尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用測定功能飲料、多維片及奶粉中維生素B12

劉德曄　谷靜等

摘要 建立了固相微萃?。⊿PE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（SECICPMS）聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內(nèi)線性良好，回歸系數(shù)R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結(jié)果與商品標(biāo)示值接近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標(biāo)回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標(biāo)回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關(guān)鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質(zhì)譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據(jù)取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及某些蛋白質(zhì)的合成的過程中產(chǎn)生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩(wěn)定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經(jīng)換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標(biāo)方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標(biāo)準(zhǔn)方法采用復(fù)雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）嘗試測定傳統(tǒng)方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質(zhì)，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯(lián)用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品、生物材料、環(huán)境等領(lǐng)域有有廣泛的應(yīng)用[16～20]，它結(jié)合了色譜的高效分離優(yōu)勢和電感耦合等離子體質(zhì)譜的高靈敏度和低干擾的優(yōu)點，除了用于形態(tài)分析， 還可用于傳統(tǒng)方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統(tǒng)國標(biāo)法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優(yōu)勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應(yīng)用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質(zhì)（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質(zhì)譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發(fā)采集數(shù)據(jù)；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環(huán)有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環(huán)后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環(huán)。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經(jīng)調(diào)諧儀器主要參數(shù)如表1所示。

摘要 建立了固相微萃取（SPE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（SECICPMS）聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內(nèi)線性良好，回歸系數(shù)R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結(jié)果與商品標(biāo)示值接近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標(biāo)回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標(biāo)回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關(guān)鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質(zhì)譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據(jù)取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及某些蛋白質(zhì)的合成的過程中產(chǎn)生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩(wěn)定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經(jīng)換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標(biāo)方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標(biāo)準(zhǔn)方法采用復(fù)雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）嘗試測定傳統(tǒng)方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質(zhì)，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯(lián)用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品、生物材料、環(huán)境等領(lǐng)域有有廣泛的應(yīng)用[16～20]，它結(jié)合了色譜的高效分離優(yōu)勢和電感耦合等離子體質(zhì)譜的高靈敏度和低干擾的優(yōu)點，除了用于形態(tài)分析， 還可用于傳統(tǒng)方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統(tǒng)國標(biāo)法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優(yōu)勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應(yīng)用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質(zhì)（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質(zhì)譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發(fā)采集數(shù)據(jù)；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環(huán)有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環(huán)后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環(huán)。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經(jīng)調(diào)諧儀器主要參數(shù)如表1所示。

摘要 建立了固相微萃?。⊿PE）柱凈化，尺寸排阻色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜（SECICPMS）聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中維生素B12含量的方法，方法檢出限為 0.4 μg/L，維生素B12在1.0～150 μg/L范圍內(nèi)線性良好，回歸系數(shù)R>0.999。實驗表明，乙腈作為維生素B12標(biāo)準(zhǔn)品溶劑可改善維生素B12的色譜行為，用乙腈作為SPE柱洗脫液比甲醇效果好。在嬰兒奶粉的前處理過程中，三氯甲烷作為蛋白沉淀劑得到的維生素B12回收率較高。功能飲料、多維片和3種嬰兒奶粉的檢測結(jié)果與商品標(biāo)示值接近，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于 5%（n=6），功能飲料、多維片的平均加標(biāo)回收率為97%和90%，5種奶粉的平均加標(biāo)回收率范圍為88%～92%，表明本方法能夠滿足日常分析的要求。

關(guān)鍵詞 尺寸排阻色譜，電感耦合等離子體質(zhì)譜，維生素B12，嬰兒奶粉

1引言

維生素B12是一族含鈷的維生素，又稱鈷胺素，根據(jù)取代基的不同可分為氰鈷胺、甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺，高等動物無法自身合成鈷胺素，只能從食物中攝取，鈷胺素在紅細胞生成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及某些蛋白質(zhì)的合成的過程中產(chǎn)生重要作用。鈷胺素中甲鈷胺、羥鈷胺和腺苷鈷胺均不穩(wěn)定，添加于保健品和嬰兒奶粉中的鈷胺素為人工合成的氰鈷胺[1～3]，氰鈷胺是以鈷為中心的配合物，其分子量為1355.4，含鈷量為4.3%。中國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定嬰兒奶粉中必須添加維生素B12， 其含量范圍經(jīng)換算后為10～72 ng/g， 市售嬰兒奶粉維生素B12添加量集中在10～20 ng/g[4]。

目前，保健品中維生素B12測定國標(biāo)方法為液相色譜法（HPLC）[5]，但HPLC方法因靈敏度較低，只適用于維生素B12含量較高的保健品的測定，無法實際測得含量在 ng/g級嬰兒奶粉中的維生素B12[6～8]，因此中國國家標(biāo)準(zhǔn)方法采用復(fù)雜且耗時的微生物法[9]測定。近年來，一些色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）嘗試測定傳統(tǒng)方法較難檢測的維生素B12[10]。Luo等[11]等利用酶消解的方法消除了保健品和奶粉中蛋白質(zhì)，再用LCMS測得了維生素B12的含量，色譜保留時間約為9 min， 方法檢出限為2 ng/g，但基質(zhì)干擾較為嚴(yán)重。Raju等[12]采用溶解離心取清液的方式提取早餐谷物和多維片中的維生素B12， 再由基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用測定，保留時間為9 min，方法檢出限小于1 ng/g。Yang等[13]采用微波輔助萃取的方式提取保健品中的維生素B12，再由基于C18柱的HPLCICPMS定量測定，保留時間為9 min。Baker等[14]采用CEICPMS聯(lián)用的方法研究了各種鈷胺素的色譜行為。Guggisberg等[15]用免疫親和柱富集HPLC檢測的方法測定了肉類食品中維生素B12的含量，富集后的檢出限為2 ng/g。

近年來，色譜電感耦合等離子質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在食品、生物材料、環(huán)境等領(lǐng)域有有廣泛的應(yīng)用[16～20]，它結(jié)合了色譜的高效分離優(yōu)勢和電感耦合等離子體質(zhì)譜的高靈敏度和低干擾的優(yōu)點，除了用于形態(tài)分析， 還可用于傳統(tǒng)方法難測得的痕量組分的測定。本實驗采用固相微萃取柱富集SECICPMS聯(lián)用測定功能飲料、多維片和嬰兒奶粉中的人為添加的維生素B12。與傳統(tǒng)國標(biāo)法相比， 本方法取樣量小、試劑人工消耗少、周期短，尤其對奶粉的測定具有獨特優(yōu)勢，與基于C18柱的HPLCICPMS聯(lián)用的方法相比，本方法不需要會影響霧化效率的高濃度甲醇作為流動相，靈敏度高，峰型尖銳， 分析時間短，分析了文獻未嘗試較難測定的奶粉樣品[11，12]。隨著色譜電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的普及，基于SECHPLCMS測定維生素B12的方法會得到廣泛的應(yīng)用。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

LC20AB液相色譜儀（日本島津公司），BioSeps2000尺寸排阻色譜柱可分離0.87～300 kDa的物質(zhì)（美國菲羅門公司）；X7電感耦合等離子體質(zhì)譜儀及其工作站（美國Thermal）；色譜與ICPMS用Peek管相連，電子觸發(fā)采集數(shù)據(jù)；繪圖軟件OriginPro 7.0；MilliQ Gradient超純水凈化器（美國Millipore）；318型離心機（美國Sigma公司）；0.22 μm有機濾膜（中國楚定科技公司）；OASIS HLB C18 SPE柱（3 mL，60 mg，美國Waters公司）。

鈷標(biāo)準(zhǔn)溶液1000 mg/L（美國Spex公司）；維生素B12（氰鈷胺，美國SigmaAldrich公司）；NaH2PO4， Na2HPO4， HCl和NaOH均為分析純，乙腈、甲醇均為色譜純；功能飲料、多維片、5個奶粉樣品采集于商場的品牌奶粉（編號1～5），所采集樣品已注明添加的維生素B12為氰鈷胺。

2.2SEC色譜條件以及ICPMS條件

2.2.1SEC色譜條件ICPMS在無加氧裝置的情況下不耐受有機流動相，因此本實驗流動相為無機磷酸緩沖鹽，但高濃度的磷酸緩沖鹽會使采樣錐和截取錐口處沉積鹽分，選擇低濃度磷酸鹽有利于保護儀器，最終實驗采用10 mmol/L磷酸鹽溶液作為流動相，流速為0.7 mL/min。

通常，高容量的定量環(huán)有利于提高靈敏度，但實驗在洗脫SPE柱時采用了有機溶劑，而進樣液中大量有機溶劑會使ICPMS熄火，考察20， 50 ，100和200 μL的定量環(huán)后， 確定50 μL試液不會使ICPMS熄滅，實驗采用50 μL定量環(huán)。

2.2.2ICPMS條件選擇Co59作為定量同位素，經(jīng)調(diào)諧儀器主要參數(shù)如表1所示。