納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法分析蜈蚣提取蛋白質(zhì)

陳霞　文紅梅等

摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nanoRPLCMS/MS）法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物，并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為：上樣8 μL， 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脫90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì)，直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì)，二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對，分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性，其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大，且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 蜈蚣； 蛋白質(zhì)； 聚丙烯酰胺凝膠電泳

1 引 言

蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥體 [1 ]，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效，已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白質(zhì)為其主要成分，占總成分的50%～70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少，Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物，Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽，藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析，并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析，較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì)，為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

納升級液相色譜系統(tǒng)：EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng)，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)：TripleTOFTM5600，配有電噴霧離子源（ESI）、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件（美國AB Sciex公司）。垂直凝膠電泳儀（美國Biorad公司）；離心濃縮儀（美國Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美國Millipore公司）。

十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（UREA）購于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega質(zhì)譜測序級）。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級（德國Merck公司）。

蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司，產(chǎn)地湖北（批號111001），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥體。

2.2 蜈蚣總蛋白的提取

蜈蚣藥材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解緩沖溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇終濃度為70%，沉淀蛋白。離心后，取沉淀用70%乙醇洗滌2次，沉淀經(jīng)離心濃縮干燥，

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2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

2.3.1 直接酶解

取蜈蚣蛋白約200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至終濃度為40 mmol/L，室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白，10000 r/min離心20 min，棄去上清液， 用70%乙醇洗滌沉淀2次，將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解過夜，得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液，煮沸5 min后上樣到配好的凝膠（分離膠濃度12%，濃縮膠5%），10 mV電泳，溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時，停止電泳。硝酸銀染色后，依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

2.4 NanoLCMS/MS分析

膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液，ZipTip脫鹽，經(jīng)離心濃縮儀干燥后，0.1%甲酸溶液復(fù)溶，高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng)，色譜條件為：Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流動相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自動進樣，上樣8 μL。梯度洗脫條件為： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析時間90 min。

摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nanoRPLCMS/MS）法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物，并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為：上樣8 μL， 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脫90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì)，直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì)，二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對，分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性，其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大，且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 蜈蚣； 蛋白質(zhì)； 聚丙烯酰胺凝膠電泳

1 引 言

蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥體 [1 ]，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效，已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白質(zhì)為其主要成分，占總成分的50%～70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少，Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物，Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽，藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析，并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析，較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì)，為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

納升級液相色譜系統(tǒng)：EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng)，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)：TripleTOFTM5600，配有電噴霧離子源（ESI）、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件（美國AB Sciex公司）。垂直凝膠電泳儀（美國Biorad公司）；離心濃縮儀（美國Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美國Millipore公司）。

十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（UREA）購于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega質(zhì)譜測序級）。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級（德國Merck公司）。

蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司，產(chǎn)地湖北（批號111001），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥體。

2.2 蜈蚣總蛋白的提取

蜈蚣藥材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解緩沖溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇終濃度為70%，沉淀蛋白。離心后，取沉淀用70%乙醇洗滌2次，沉淀經(jīng)離心濃縮干燥，

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2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

2.3.1 直接酶解

取蜈蚣蛋白約200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至終濃度為40 mmol/L，室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白，10000 r/min離心20 min，棄去上清液， 用70%乙醇洗滌沉淀2次，將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解過夜，得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液，煮沸5 min后上樣到配好的凝膠（分離膠濃度12%，濃縮膠5%），10 mV電泳，溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時，停止電泳。硝酸銀染色后，依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

2.4 NanoLCMS/MS分析

膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液，ZipTip脫鹽，經(jīng)離心濃縮儀干燥后，0.1%甲酸溶液復(fù)溶，高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng)，色譜條件為：Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流動相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自動進樣，上樣8 μL。梯度洗脫條件為： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析時間90 min。

摘 要 結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳和納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（nanoRPLCMS/MS）法系統(tǒng)分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物，并進行數(shù)據(jù)庫檢索鑒定蛋白質(zhì)。建立的nanoLC分析條件為：上樣8 μL， 經(jīng)Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm，3 μm），2%乙腈（0.1%甲酸）98%乙腈（0.1%甲酸）梯度洗脫90 min；采用ESIQTOF MS，并在IDA采集模式下分析鑒定蜈蚣提取蛋白質(zhì)。膠內(nèi)酶解鑒定到 72 種蛋白質(zhì)，直接酶解鑒定到 97 種蛋白質(zhì)，二者含26種相同的蛋白質(zhì)。通過數(shù)據(jù)庫比對，分析了蜈蚣提取蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分以及功能活性。得到蜈蚣蛋白質(zhì)具有結(jié)合、酶催化、肌動等功能活性，其中結(jié)合活性的蛋白質(zhì)占的比例較大，且多為能量代謝進程中的相關(guān)酶類。

關(guān)鍵詞 納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 蜈蚣； 蛋白質(zhì)； 聚丙烯酰胺凝膠電泳

1 引 言

蜈蚣為節(jié)肢動物門唇足綱整形目蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipes.mutilans L. Koch）的干燥體 [1 ]，具有息風(fēng)鎮(zhèn)痙、通絡(luò)止痛、攻毒散結(jié)等功效，已廣泛用于臨床疾病的治療。蜈蚣主要含有蛋白質(zhì)、脂肪酸、氨基酸、總脂、微量元素等 [2～4 ]，且蛋白質(zhì)為其主要成分，占總成分的50%～70%。藥理研究表明其具有抗腫瘤 [5，6 ]、抗凝血 [7，8 ]、抗驚厥 [9 ]、抗菌 [10 ]等活性。蜈蚣蛋白的研究較少，Zhao等 [11 ]從蜈蚣中分離純化得到一種具有抗腫瘤和免疫活性的多糖蛋白復(fù)合物，Kong等 [12 ]從蜈蚣中提取分離出一種多肽，藥理實驗顯示具有抗血栓活性。但目前尚缺少對蜈蚣蛋白質(zhì)的系統(tǒng)分析方法。本研究首次引入蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，建立了高靈敏、高通量的納升級反相液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳對蜈蚣提取蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶解和直接酶解產(chǎn)物進行分析，并對鑒別到的蛋白質(zhì)的生物進程、細胞組分及功能活性進行分析，較系統(tǒng)地研究了蜈蚣提取蛋白質(zhì)，為蜈蚣蛋白質(zhì)的研究提供了新方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

納升級液相色譜系統(tǒng)：EksigentekspertTM nanoLC液相系統(tǒng)，Eksigent software V.3.12液相工作站；高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)：TripleTOFTM5600，配有電噴霧離子源（ESI）、Analyst TF 1.6色譜工作站、Peak View 1.2質(zhì)譜分析軟件和ProteinPilot 4.5蛋白質(zhì)分析軟件（美國AB Sciex公司）。垂直凝膠電泳儀（美國Biorad公司）；離心濃縮儀（美國Labconco公司）；ZipTipC18 Pipette Tips（美國Millipore公司）。

十二烷基磺酸鈉（SDS）、二硫蘇糖醇（DTT）、尿素（UREA）購于Biosharpp公司；碘乙酰胺（IAA，Aladdin公司）；胰蛋白酶（Trypsin，Promega質(zhì)譜測序級）。乙腈、甲醇、甲酸等質(zhì)譜用試劑均為質(zhì)譜級（德國Merck公司）。

蜈蚣購于江蘇省萬生中藥飲片有限公司，產(chǎn)地湖北（批號111001），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室陳建偉教授鑒定為少棘巨蜈蚣（Scolopendrasubspinipesmutilans L. Koch）的干燥體。

2.2 蜈蚣總蛋白的提取

蜈蚣藥材粉碎后，取粗粉20 mg，加入裂解緩沖溶液（2% SDS，20 mmol/L DTT， 50 mmol/L PBS pH 7.8） 2 mL，65 ℃水浴中孵育過夜。10000 r/min離心20 min，上清液加入乙醇， 使乙醇終濃度為70%，沉淀蛋白。離心后，取沉淀用70%乙醇洗滌2次，沉淀經(jīng)離心濃縮干燥，

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2.3 蜈蚣蛋白質(zhì)酶解

2.3.1 直接酶解

取蜈蚣蛋白約200 μg，加2%SDS，20 mmol/L DTT，50 mmol/L PBS溶液125 μL， 37 ℃孵育60 min， 加入IAA至終濃度為40 mmol/L，室溫避光孵育60 min。加入乙醇至終濃度約為70%沉淀蛋白，10000 r/min離心20 min，棄去上清液， 用70%乙醇洗滌沉淀2次，將洗滌后的蛋白質(zhì)溶于含2mol/L尿素的50 mmol/L NH4HCO3溶液中，加入3 μg的胰蛋白酶（50 ∶ 1～100 ∶ 1），37 ℃酶解過夜，得蜈蚣蛋白質(zhì)直接酶解液。

2.3.2 SDSPAGE及膠內(nèi)酶解

蜈蚣總提取液經(jīng)考馬斯亮藍測定濃度后加入樣品溶解液，煮沸5 min后上樣到配好的凝膠（分離膠濃度12%，濃縮膠5%），10 mV電泳，溴酚藍距凝膠邊緣約5 mm時，停止電泳。硝酸銀染色后，依此經(jīng)過切膠、浸洗、蛋白質(zhì)降解、烷基化、胰酶酶解、多肽抽提，得蜈蚣蛋白質(zhì)膠內(nèi)酶解液。

2.4 NanoLCMS/MS分析

膠內(nèi)及直接酶解液12000 r/min離心后取上清液，ZipTip脫鹽，經(jīng)離心濃縮儀干燥后，0.1%甲酸溶液復(fù)溶，高速離心后取上清液注入nanoLCMS/MS儀器分析。

液相為EksigentekspertTM NanoLC液相系統(tǒng)，色譜條件為：Chrom XPC18毛細管柱（350 μm×0.5 mm， 3 μm）；流動相A：2%乙腈（0.1%甲酸），B：98%乙腈（0.1%甲酸）；流速300 nL/min，自動進樣，上樣8 μL。梯度洗脫條件為： 0～54 min，5%～25%B；54～75 min，25%～55%B；75～77 min，55%～80%B；77～83 min，80% B；83～90 min，80%～5%B，分析時間90 min。