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      腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝研究

      2014-03-04 21:39:15張蔚江曙等
      分析化學(xué) 2014年2期
      關(guān)鍵詞:超純水菌液質(zhì)譜

      張蔚 江曙等

      摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

      關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

      1 引 言

      人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]??诜幬镞M(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

      阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

      2 實(shí)驗(yàn)部分

      2.1 儀器與試劑

      UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

      阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

      準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

      2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

      稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

      2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

      收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

      摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

      關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

      1 引 言

      人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]。口服藥物進(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

      阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

      2 實(shí)驗(yàn)部分

      2.1 儀器與試劑

      UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

      阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

      準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

      2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

      稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

      2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

      收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

      摘 要 研究人體腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝。采集健康志愿者新鮮糞便,稱重稀釋后厭氧培養(yǎng),通過反復(fù)涂布分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS)與MetabolynxTM軟件分析阿魏酸經(jīng)人體糞便混合菌及分離的單菌作用后的代謝產(chǎn)物,共鑒定出了3種代謝產(chǎn)物,分別是氫化產(chǎn)物、去甲基化產(chǎn)物及去甲氧基化產(chǎn)物;此外,篩選出了對(duì)阿魏酸有特殊代謝活性的2種單菌,其中一種為已鑒定了的Bacillus sp.46; 而另一種未知的細(xì)菌則用16S核糖體RNA(16S rRNA)技術(shù)進(jìn)行了鑒定,結(jié)果表明,此細(xì)菌為Enterococcus sp.45。本研究提示腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸有代謝作用且由不同細(xì)菌完成。

      關(guān)鍵詞 阿魏酸; 腸道細(xì)菌; 超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)

      1 引 言

      人腸道中大約有100多種總數(shù)超過108的細(xì)菌棲息,其中99%為厭氧菌,這些細(xì)菌統(tǒng)稱為“腸內(nèi)細(xì)菌群”,共同構(gòu)成了腸道的微生態(tài)環(huán)境 [1,2 ]。腸道菌群能產(chǎn)生多種藥物代謝酶,主要包括水解酶、氧化還原酶、裂解酶和轉(zhuǎn)移酶等 [3 ]??诜幬镞M(jìn)入腸道后,不可避免地在腸道菌群作用下發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化,產(chǎn)生出具有不同生物活性的代謝產(chǎn)物,因此腸道菌群在人體的藥物代謝活動(dòng)中起著重要作用 [4 ]。

      阿魏酸(Ferulic acid),化學(xué)名為4羥基3甲氧基苯丙烯酸,是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊等多種中藥的有效成分之一。藥理實(shí)驗(yàn)表明,阿魏酸具有效抗血小板凝集和血栓、抗氧化,抗腫瘤、抗突變、增加免疫力等多種作用 [5,6 ],已成為臨床常用的活血祛瘀藥物之一。目前,已有大量關(guān)于阿魏酸體內(nèi)代謝研究的報(bào)道 [7,8 ],但有關(guān)人體腸道混合菌及單種細(xì)菌對(duì)阿魏酸的生物轉(zhuǎn)化研究卻鮮有報(bào)道 [9 ]。本研究采集了健康志愿者新鮮糞便, 通過反復(fù)的涂布和培養(yǎng), 最終分離得到69種人體腸道細(xì)菌。采用超高效液相四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(UPLCQTOF/MS) 與MetabolynxTM軟件 [10 ]尋找阿魏酸與人體腸道混合菌及單菌培養(yǎng)后的代謝產(chǎn)物, 并用16S核糖體RNA技術(shù) (16S rRNA)對(duì)具有特殊代謝活性的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定, 鑒定出了對(duì)阿魏酸具有代謝活性的細(xì)菌,為全面了解腸道細(xì)菌對(duì)阿魏酸的代謝提供了依據(jù)。

      2 實(shí)驗(yàn)部分

      2.1 儀器與試劑

      UPLC AcquityTM系統(tǒng) (Waters公司);SynaptTM QTOF 質(zhì)譜儀 (Waters公司),配有電噴霧離子源 (ESI);Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件 (Waters公司);MetaboLynxTM分析軟件(Waters公司);MLS3750型高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司);GNP9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司);WD9402A型PCR擴(kuò)增儀(北京六一儀器公司);DYY8C電泳儀(北京六一儀器公司);TGL16B高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);XW80A微型渦旋混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司);TD2102電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);EPED型超純水系統(tǒng)(南京易普達(dá)易科技發(fā)展有限公司)。

      阿魏酸(中國藥品生物制品檢定所,批號(hào) 110773201012);PfuX7(DNA聚合酶)、Pfu buffer(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)緩沖液)、dNTPs(4種脫氧核糖核酸)、DNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒(上海博亞生物技術(shù)有限公司);乙腈與甲酸為色譜純,其余試劑為分析純。

      準(zhǔn)確稱取阿魏酸對(duì)照品適量,用超純水超聲溶解,配制成2.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液, 4 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

      2.2 普通厭氧培養(yǎng)液(GAM)的配制、滅菌

      稱取胰蛋白胨10.00 g,大豆蛋白胨3.00 g,朊胨10.00 g,酵母浸膏5.00 g,血清消化粉13.50 g,牛肝浸出粉1.20 g,牛肉膏2.20 g,葡萄糖3.00 g,KH2PO4 2.50 g,NaCl 3.00 g,可溶性淀粉5.00 g,L半胱氨酸鹽0.30 g,硫代乙醇酸鈉0.30 g,用超純水加熱溶解,調(diào)節(jié)至pH 7.2并最終定容至1000 mL。準(zhǔn)確稱取2.70 g NaCl,用超純水定容至300 mL。將厭氧培養(yǎng)液及生理鹽水在121℃的高壓蒸汽滅菌鍋中滅菌20 min,冷卻備用 [11 ]。

      2.3 人體腸道菌液的制備及細(xì)菌的分離、培養(yǎng)

      收集健康女性志愿者(受試者無腸道疾病或代謝性疾病史,且在采樣前3個(gè)月內(nèi)未服用過任何抗生素或益生素)的新鮮糞便5.0 g,與生理鹽水按比例1 ∶ 4 (g/mL)比例混合,渦旋2 min制成混懸液,再1000 r/min離心10 min得上清液,即為腸道菌液 [12 ]。 將腸道菌液加到生理鹽水中連續(xù)稀釋,吸取0.1 mL適當(dāng)濃度的稀釋液接種在GAM瓊脂平板上, 均勻涂布,并在37 ℃厭氧培養(yǎng)。經(jīng)過傳代馴化和反復(fù)平板涂布,分離出69種細(xì)菌,標(biāo)號(hào)為sp.1~sp.69并冷凍保存在4℃冰箱中,以便后面研究使用 [13 ]。

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