陳健綜述 金承洛審校

綜 述

腎細(xì)胞癌干細(xì)胞研究進(jìn)展

陳健綜述 金承洛審校

腫瘤；腎細(xì)胞癌；干細(xì)胞

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma, RCC )的發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占2%～3%[1]。腎癌細(xì)胞對(duì)化療、放療不敏感，具有多藥耐藥性[2]，而免疫治療僅對(duì)10%～20%患者有作用，手術(shù)切除是目前治療腎癌的首選，但腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高達(dá)40%[3]。2001年Reya等[4]提出了腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)，近年國(guó)內(nèi)外對(duì)RCC干細(xì)胞進(jìn)行大量的研究，并關(guān)注RCC干細(xì)胞的靶向治療，希望找到RCC干細(xì)胞的特異性較高的表面標(biāo)志物，探索RCC干細(xì)胞生存微環(huán)境，進(jìn)而找到治療腎癌的新途徑，下文就近期腎癌干細(xì)胞的研究現(xiàn)狀作一綜述如下。

1 腫瘤干細(xì)胞及腎癌干細(xì)胞理論

在過(guò)去相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里， 腫瘤被認(rèn)為是由腫瘤細(xì)胞構(gòu)成的均一組織，每個(gè)惡性腫瘤細(xì)胞都具備無(wú)限的增殖能力，只要生長(zhǎng)環(huán)境適宜，每個(gè)腫瘤細(xì)胞都具有致瘤能力。1958年，Hewitt[5]把小鼠急性髓系白血病腫瘤細(xì)胞移植到同品系的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這批移植小鼠體內(nèi)多數(shù)沒(méi)有形成腫瘤，僅有1%～4%能夠形成脾臟內(nèi)克隆，因此他們認(rèn)為不是每個(gè)腫瘤細(xì)胞都具有無(wú)限的增殖能力，腫瘤細(xì)胞的致瘤能力可能是通過(guò)一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出來(lái)的。數(shù)十年后，腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出，認(rèn)為腫瘤細(xì)胞之間存在固有差異[6]，在腫瘤組織中存在一小群具備自我更新和不定分化潛能的細(xì)胞，是腫瘤形成的起始細(xì)胞并維持腫瘤的生長(zhǎng)，而其他絕大部分腫瘤細(xì)胞只具備有限的增殖能力。Al-Awqati等[7]提出了RCC干細(xì)胞的假設(shè)，認(rèn)為RCC主要是由致癌性能的RCC干細(xì)胞和無(wú)致癌性能的其他細(xì)胞組成，RCC干細(xì)胞很可能是RCC的種子細(xì)胞，可能來(lái)源于近端腎小管祖細(xì)胞等腎臟細(xì)胞。Bonnet 等[8]成功分離出人類(lèi)AML干細(xì)胞，腫瘤干細(xì)胞假設(shè)的理論逐步得到了證實(shí)。此后在腦腫瘤[9]、前列腺癌[10]等實(shí)體瘤中也證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。目前認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs)/(tumor stem cells，TSCs)是一群存在腫瘤組織中數(shù)目極少的干細(xì)胞樣細(xì)胞，具有干細(xì)胞所具有的自我更新能力和多向分化增殖潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的起始細(xì)胞[11]，腫瘤干細(xì)胞理論仍處起始階段，我們所說(shuō)的腫瘤干細(xì)胞，是因?yàn)檫@種細(xì)胞在某些方面表現(xiàn)出了干細(xì)胞的特性，所以有些文獻(xiàn)稱(chēng)之為Cancer stem-like cells 或tumor-initiating cells 。

早在腫瘤干細(xì)胞理論提出之前,Bander 等[12]應(yīng)用單克隆抗體探針技術(shù)研究腎癌細(xì)胞起源的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)腎癌組織中，小部分細(xì)胞表型和正常胎兒近端腎小管祖細(xì)胞表型一致，表達(dá)相同的抗原。胚胎時(shí)期的腎臟細(xì)胞和小部分的腎癌組織細(xì)胞均產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α((TGF-α)，而正常成熟腎臟細(xì)胞則沒(méi)有檢測(cè)到此因子的表達(dá)。根據(jù)以上結(jié)果可推斷，RCC細(xì)胞中小部分細(xì)胞的特性與胚胎時(shí)期腎臟部分細(xì)胞極為相似，提示了RCC干細(xì)胞存在可能。直到2005年，F(xiàn)lorek 等[13]利用體外球體形成實(shí)驗(yàn)從腎癌細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)RCC干細(xì)胞，證實(shí)了腎癌干細(xì)胞的存在。目前基于腎癌組織中這種干樣細(xì)胞存在的理解有2種：(1)這種表現(xiàn)出干細(xì)胞特性的干樣細(xì)胞可能是位于腎癌組織中的正常腎臟干細(xì)胞，在腫瘤組織中促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和血管形成；(2)也可能是正常的腎臟干細(xì)胞惡化后形成的最原始的腫瘤細(xì)胞，在不同微環(huán)境誘導(dǎo)下分化形成具有不同特性的腫瘤細(xì)胞群，進(jìn)而形成不同病理類(lèi)型和不同惡性程度的腫瘤組織。

2 腎癌(腫瘤)干細(xì)胞標(biāo)志物

2.2 三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白G超家族成員2( ATP-binding cassette transporter,ABCG2)ABCG2 作為一種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,是由655個(gè)氨基酸組成的，具有6個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)核結(jié)合區(qū)[17]。當(dāng)用DNA熒光染料Hoechest33342對(duì)不同的細(xì)胞進(jìn)行染色時(shí)，某些腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞核不著色或者很低程度的著色，研究者們將這部分細(xì)胞稱(chēng)為側(cè)群(SP)細(xì)胞，SP細(xì)胞高表達(dá)ABCG2。研究者們證實(shí)腎癌組織中分布有SP細(xì)胞，也高表達(dá)ABCG2。腎癌具有對(duì)化療不敏感、多藥耐藥性的特點(diǎn)，而ABCG2的主要作用恰恰就是把包括化療藥物在內(nèi)的多種藥物泵出細(xì)胞外[18]，進(jìn)而使得腫瘤組織表現(xiàn)出耐藥性。由此可以推測(cè)SP細(xì)胞標(biāo)記物ABCG2在腎癌的耐藥中可能起著關(guān)鍵的作用，所以ABCG2有理由成為腎癌干細(xì)胞的表面標(biāo)志物，但是其特異性還有待檢測(cè)。

2.3 Oct-4 Oct-4是一種在胚胎干細(xì)胞和精原細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，是維持胚胎干細(xì)胞的多分化潛能的重要因子，增殖不旺盛或者成熟的分化組織中一般檢測(cè)不到Oct-4的存在，通常認(rèn)為是胚胎干細(xì)胞的標(biāo)記物。研究者們發(fā)現(xiàn)Oct-4在絕大多數(shù)的RCC標(biāo)本中呈陽(yáng)性表達(dá)[19]，而正常腎皮質(zhì)組織和癌旁組織中未檢測(cè)到Oct-4表達(dá)。Oct-4已經(jīng)證實(shí)的作用為維持細(xì)胞的分化潛能[20]，癌組織中只有一小部分細(xì)胞具有這種能力，Oct-4可能就表達(dá)在腫瘤干樣細(xì)胞。研究者們只是證實(shí)了腎癌組織中Oct-4的高表達(dá)，還未能在單個(gè)特定細(xì)胞上明確其表達(dá)。

2.4 BMI-1 BMI-1基因是多梳基因(polycomb group gene)家族重要的調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)同源盒基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞周期蛋白激酶抑制基因p16Ink4a表達(dá)，在維持正常干細(xì)胞自我更新和多向分化方面起到重要作用。BMI-1的表達(dá)主要分布于胞漿，大部分呈彌漫性全漿分布，少數(shù)分布于胞核或胞核周?chē)鶾21]；研究表明BMI- 1表達(dá)陽(yáng)性率與腎透明細(xì)胞癌的分化程度呈反比,推測(cè)其參與了腎癌的發(fā)生，Liu 等[22]發(fā)現(xiàn)BMI-1 的表達(dá)與腫瘤組織內(nèi)干樣細(xì)胞對(duì)腫瘤組織的調(diào)節(jié)有關(guān)。除腎癌外，BMI-1基因在維持促白血病干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞等腫瘤干細(xì)胞增殖能力方面的作用已經(jīng)得到證實(shí)。因此有理由根據(jù)BMI-1 的表達(dá)鑒別腎癌干細(xì)胞。

3 腎癌干細(xì)胞的培養(yǎng)及篩選方法

3.1 SP細(xì)胞分選法 基于腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞膜上ABCG2跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能將DNA結(jié)合染料排出細(xì)胞而不被染色的特性，采用熒光激活細(xì)胞分類(lèi)術(shù)(FACS)技術(shù)就可以從單細(xì)胞懸液中分選出不染色的SP細(xì)胞。

3.3 體外球體形成實(shí)驗(yàn) 體外球體形成實(shí)驗(yàn)已經(jīng)被認(rèn)為是一種有用的腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)和分離方法。從腦腫瘤組織中分離得到的細(xì)胞懸浮于含有表皮生長(zhǎng)因子(EGF)和成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)的無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，小部分細(xì)胞能生長(zhǎng)為一個(gè)細(xì)胞球體[23]。這部分細(xì)胞展現(xiàn)出自我更新能力、更高的干細(xì)胞樣基因mRNA表達(dá)水平，更強(qiáng)的致瘤性以及對(duì)抗腫瘤藥物的更頑強(qiáng)的抵抗能力。有研究證實(shí)[24]，在非附著培養(yǎng)條件下，以多細(xì)胞球或者球形細(xì)胞聚集體方式形成集落的能力是許多具有自我更新能力細(xì)胞的一種特點(diǎn)。在此方法指導(dǎo)下，2005年Florek等[13]從腎癌組織中發(fā)現(xiàn)腎癌干細(xì)胞的存在。

3.4 利用干細(xì)胞慢周期的特性分離提取 溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)能夠在細(xì)胞處于S期時(shí)，滲入細(xì)胞中標(biāo)記到新合成的DNA鏈中，能夠標(biāo)記到細(xì)胞周期較長(zhǎng)的成體干細(xì)胞中并能保留較長(zhǎng)的時(shí)間，在細(xì)胞免疫組化中應(yīng)用廣泛。2004年，Oliver等[25]利用BrdU此特性，追蹤觀(guān)察了正常腎臟干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腎乳頭是腎臟干細(xì)胞集中的部位。這種細(xì)胞在腎臟受到損傷，特別是缺血性損傷的時(shí)候就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞周期，參與病損修復(fù)。體外培養(yǎng)這種細(xì)胞，表現(xiàn)出極強(qiáng)的增殖能力和多能性[26]，因此認(rèn)為這些細(xì)胞就是腎臟干細(xì)胞，關(guān)于腎癌干細(xì)胞，目前還沒(méi)有用此染料追蹤尋找的案例，但Oliver的實(shí)驗(yàn)對(duì)于腎癌干細(xì)胞的篩選具有指導(dǎo)意義。

4 以腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)治療癌癥的初嘗試

分析腫瘤干細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物，尋找到腫瘤干細(xì)胞特異性表達(dá)抗原，根據(jù)此標(biāo)志物抗原，尋找及利用相應(yīng)抗體，達(dá)到抗腫瘤干細(xì)胞的作用，從而起到抗腫瘤的作用。此方法首次在A(yíng)ML中取得了突破性進(jìn)展，研究者們用一種腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44的抗體[28]，清除了接種AML的免疫缺陷小鼠體內(nèi)的AML干細(xì)胞。此方法尚未在實(shí)體腫瘤中嘗試過(guò)，但對(duì)于腎癌等實(shí)體腫瘤具有指導(dǎo)意義。

研究者發(fā)現(xiàn)利用細(xì)胞因子IL-15處理腎癌干細(xì)胞，對(duì)常規(guī)抗腫瘤藥物更敏感[29]。Azzi等[30]利用對(duì)比實(shí)驗(yàn)證實(shí)接觸過(guò)白介素-15的腎腫瘤組織對(duì)順鉑、長(zhǎng)春堿、紫杉醇等常規(guī)抗腫瘤藥物更敏感。對(duì)比結(jié)果示IL-15處理后的標(biāo)本腎癌干細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，IL-15如何導(dǎo)致腎癌干細(xì)胞減少的機(jī)制不明確，但是腎癌干細(xì)胞較少的腎癌組織對(duì)抗腫瘤藥物敏感，很有可能是由于腎癌干細(xì)胞缺失，降低了腎癌組織耐藥性所致[31]。

5 意義及展望

腫瘤干細(xì)胞理論的提出，使人們對(duì)包括腎癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的認(rèn)識(shí)發(fā)生了革命性的變化，基于腎癌干細(xì)胞的研究進(jìn)展，進(jìn)一步推動(dòng)了對(duì)腫瘤干細(xì)胞各種生物學(xué)特征和生物學(xué)行為分子機(jī)制的探索，為重新認(rèn)識(shí)腫瘤的起源和本質(zhì)，以及腫瘤的臨床治療提供了新的明確可靠的方向。

但是，作為目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，腫瘤干細(xì)胞研究在面臨巨大機(jī)遇的同時(shí)也面臨巨大挑戰(zhàn)。正如前文所述，腫瘤干細(xì)胞的起源問(wèn)題還未定論；其特異性的表面標(biāo)志物[32]和獨(dú)特的信號(hào)通路還有待于進(jìn)一步的尋找和認(rèn)識(shí)；分離和鑒定技術(shù)還不是十分成熟等。腎癌干細(xì)胞的研究起步較晚，與乳腺癌干細(xì)胞、腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞等相對(duì)較成熟的腫瘤干細(xì)胞研究相比，腎癌干細(xì)胞研究處于起始階段。隨著干細(xì)胞研究技術(shù)和應(yīng)用水平的不斷深入，腎癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志物、基因靶位將會(huì)逐步被發(fā)現(xiàn)，P13K-AKT-mTOR、EGFR、Wnt等[33]信號(hào)通路與腫瘤的關(guān)系將更加明了；腎癌干細(xì)胞特異細(xì)胞周期與不對(duì)稱(chēng)分裂的機(jī)制將被明確、利用微環(huán)境的調(diào)控及靶向藥物治療腎癌將成為可能，到那時(shí)腎癌等惡性腫瘤會(huì)被徹底根治，造福人類(lèi)。

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150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科

金承洛，E-mail:cjian0127@163.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.08.038

2014-03-14)