代謝物組學(xué)在腎病研究中的應(yīng)用

吳 瓊，董 昕，陳嘯飛，洪戰(zhàn)英，柴逸峰

[1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點實驗室，上海 200433；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433]

腎的作用在于維持酸堿平衡，調(diào)節(jié)血容量及激素分泌，對于脊椎動物的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要。腎病是以腎小球基底膜通透性增高為主的癥候群，臨床表現(xiàn)為大量蛋白尿、低蛋白血癥、高膽固醇血癥及全身水腫。腎病的病理機制復(fù)雜，目前主要依賴于有限的血清、尿液生化指標(biāo)，腎組織病理學(xué)，免疫組化及臨床表現(xiàn)進行診斷和治療，缺乏足夠的靈敏度和專屬性[1]。如臨床常用血肌酐(serum creatinine,Scr)表征腎功能，而Scr的應(yīng)用存在很多不足。(1)Scr升高前腎損傷已經(jīng)發(fā)生；(2)在腎小球濾過率較低的情況下，僅根據(jù)Scr易高估腎功能；(3)單用Scr無法推測疾病的發(fā)生機制；(4)Scr易受年齡、性別、肌肉代謝等混雜因素的影響。目前還未出現(xiàn)一種足夠靈敏和專屬的技術(shù)用于腎病早期診斷、疾病進程預(yù)測及療效評價。因此，尋找更為專屬的腎病標(biāo)志物用于腎病的早期診斷及預(yù)后評估非常重要。

代謝物組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的分支，通過全面的定性定量分析，對代謝物在機體處于正常生命狀態(tài)及內(nèi)外環(huán)境變化后的動態(tài)反應(yīng)進行研究[2]，通過高分辨的分析方法結(jié)合多元數(shù)據(jù)分析可獲取內(nèi)源和外源代謝物的全景圖像[3]，在生物標(biāo)志物篩選及治療方案選擇方面展現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景[4]。代謝物組學(xué)的研究對象為體內(nèi)所有小分子代謝物，包括代謝中間體及終產(chǎn)物，相對分子質(zhì)量大多<1 ku。代謝物組學(xué)的檢測技術(shù)涉及色譜、質(zhì)譜、電泳及核磁共振等，主要是基于色譜質(zhì)譜聯(lián)用和核磁共振兩大類檢測技術(shù)，其優(yōu)勢在于能同時表征表型和基因型的變化。與傳統(tǒng)的腎穿刺活檢術(shù)相比，代謝物組學(xué)具有病人易接受、安全、可連續(xù)采樣的優(yōu)點，可以非創(chuàng)傷性地獲得生物體液進行臨床疾病的早期診斷，為疾病分型、預(yù)后分析及個體化用藥提供幫助和支持[5]，并且其在不同腎病專屬性標(biāo)志物及代謝途徑方面的探索極大地促進了腎病機制的研究[6]。

1 代謝物組學(xué)在腎病研究中的應(yīng)用

腎病的發(fā)生、發(fā)展與全身性的代謝異常密切相關(guān)。代謝物組學(xué)在腎病研究中具有不可忽視的臨床價值。

1.1 在急性腎損傷研究中的應(yīng)用 急性腎損傷是一種流行性強且進展迅速的臨床疾病，常伴隨較高的發(fā)病率和病死率。在過去的50年里，盡管急性腎損傷在臨床護理上有顯著發(fā)展，但結(jié)局改善甚微[7]，限制臨床結(jié)果改善的最主要因素之一在于缺乏精確預(yù)測和診斷早期腎功能紊亂的方法。目前臨床上用于急性腎損傷診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為小便排出量和Scr，這兩個指標(biāo)均存在不夠靈敏、專屬，疾病預(yù)測滯后等缺點。Liu等[8]對急性腎損傷病人體內(nèi)的代謝變化做了深入研究，證實了氧化應(yīng)激和脂類代謝的紊亂在急性腎損傷中所起的作用，并且通過快速LC-MS的血清代謝物組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)與急性腎損傷相關(guān)的新標(biāo)志物，如上調(diào)的溶血磷脂、游離脂肪酸和硝基酪氨酸，以及下調(diào)的肉堿和乙酰肉堿。另有研究表明，上調(diào)的?；鈮A以及蛋氨酸、同型半胱氨酸、焦谷氨酸、不對稱二甲基精氨酸、苯丙氨酸等氨基酸，下調(diào)的精氨酸和幾種溶血性磷脂酰膽堿都與急性腎病相關(guān)，其中同型半胱氨酸、不對稱二甲基精氨酸和焦谷氨酸已經(jīng)被篩選為診斷腎病的生物標(biāo)志物[9]。

1.2 在慢性腎病研究中的應(yīng)用 腎小球濾過率<60 ml/(min·1.73 m2)持續(xù)3個月及以上的狀態(tài)被定義為慢性腎病。代謝產(chǎn)物如Scr和血尿氮常作為腎功能的標(biāo)志物，目前還沒有大規(guī)模的健康志愿者和慢性腎病病人代謝物組學(xué)方面的臨床對照研究[10]。血清代謝物組學(xué)研究表明，不同分型的慢性腎病病人內(nèi)源性代謝物輪廓存在差異，這些代謝物主要包括糖酵解、氨基酸、有機滲透物等代謝產(chǎn)物?；谶@些代謝產(chǎn)物所構(gòu)建的慢性腎病診斷模型的靈敏度和專屬性均可達到100%，鑒別的生物標(biāo)志物可為慢性腎病診斷尤其是早期治療提供有用的信息[11]。

1.3 在慢性腎衰竭研究中的應(yīng)用 慢性腎衰竭是在各種慢性腎實質(zhì)疾病的基礎(chǔ)上，緩慢地出現(xiàn)腎功能減退而至衰竭。在慢性腎衰竭的進展過程中，尿毒素在體內(nèi)的異常積聚起了重要作用[12]。Jia等[13]采用HPLC-MS法對慢性腎小球腎炎病人、未接受腎移植治療的慢性腎衰竭病人，以及正常人的血漿磷脂代謝物做全譜分析，揭示19種磷脂類物質(zhì)可能與疾病分型密切相關(guān)，慢性腎小球腎炎導(dǎo)致慢性腎衰竭病人的磷脂代謝發(fā)生改變。這些代謝輪廓的改變可用于慢性腎小球腎炎早期進展的檢測，并為慢性腎衰竭的防治提供參考。

1.4 在腎臟惡性腫瘤研究中的應(yīng)用 腎癌也叫腎癌，近年來，其發(fā)病率持續(xù)增加，一旦發(fā)病就會頻繁轉(zhuǎn)移，病人生存希望渺茫。腎癌通常是在診斷急性腎損傷或血尿病人時通過成像偶然發(fā)現(xiàn)，在這種情況下，腫瘤通常已經(jīng)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移性腎癌病人的生存期只有1～2年。 然而目前尚無有效的生化標(biāo)志物可用于腎癌的診斷，主要依賴于成像技術(shù)，而這一技術(shù)并不能篩分腎癌的表型，因此早期診斷和檢測尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，腎癌病人體內(nèi)的乳酸鹽、谷氨酸、丙酮酸鹽、谷氨酰胺和肌酐水平上調(diào)，而乙酸鹽、蘋果酸和氨基酸(包括纈氨酸、丙氨酸及天冬氨酸)水平下調(diào)[14]。一種基于LC-MS的代謝物組學(xué)方法結(jié)合多元統(tǒng)計分析可以用于區(qū)分腎癌病人和健康志愿者的血清輪廓，檢測靈敏度可達到100%，為腎癌的診斷和分型提供了支持，并且能夠很好地區(qū)分早期與晚期病人。該研究共鑒別了30個腎癌相關(guān)的代謝物，主要涉及磷脂代謝、鞘脂代謝和苯丙氨酸代謝等。該研究也證實了代謝物組學(xué)在揭示癌癥表型方面的潛能[15]。Kim等[16]用代謝物組學(xué)方法篩分了腎癌相關(guān)的尿液差異代謝物：喹啉酸、4-羥基苯甲酸和龍膽酸鹽，這些代謝物主要涉及氨基酸代謝和能量代謝。今后，在更大規(guī)模的腎癌病人中開展代謝物組學(xué)研究可能驗證潛在的生物標(biāo)志物，并實現(xiàn)腎癌的早診斷、早干預(yù)。

1.5 在免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)腎病研究中的應(yīng)用 IgA腎病是原發(fā)性腎小球腎炎病人發(fā)生慢性腎衰竭最常見的起因。目前臨床上診斷IgA腎病主要依靠腎穿刺活檢術(shù)，存在有創(chuàng)傷性、檢查過程伴隨疼痛、病人接受度低等缺點。Sui等[17]對IgA腎病病人進行了代謝物組學(xué)研究，鑒定了潛在的生物標(biāo)志物。與健康志愿者相比，IgA腎病病人有較高水平的苯丙氨酸、肌醇、乳酸鹽、L6脂類、L5脂類及L3脂類，以及較低水平的β-葡萄糖、α-葡萄糖、纈氨酸、酪氨酸、磷酸膽堿、賴氨酸、異亮氨酸、甘油磷酸膽堿、甘氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、丙氨酸、乙酸鹽、3-羥基丁酸和1-甲基組氨酸。腎間質(zhì)纖維化過程中的代謝異常主要涉及纈氨酸、異亮氨酸、乳酸鹽、3-羥基丁酸、丙氨酸、乙酰乙酸、丙酮酸鹽和谷氨酸等生物標(biāo)志物，這些生物標(biāo)志物將有助于病理機制的解釋[18]。能量代謝在腎間質(zhì)纖維化早期階段被抑制而后期又被激活，這一現(xiàn)象也由代謝物組學(xué)研究所發(fā)現(xiàn)，為腎間質(zhì)纖維化病理機制的探索提供了參考。

1.6 在常染色體主導(dǎo)的多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)研究中的應(yīng)用 ADPKD是最常見的遺傳性腎病，發(fā)病率約為1‰，其明顯特征為腎囊腫擴大，最終導(dǎo)致腎衰竭。ADPKD的診斷主要依賴于超聲和成像，然而這種診斷模式只能發(fā)現(xiàn)肉眼可見的囊腫，較為滯后，目前尚無生物標(biāo)志物用于ADPKD的診斷。大量的尿毒素類化合物會隨著腎損傷的進展持續(xù)積聚，繼而導(dǎo)致腎損傷和高血壓。特征標(biāo)志物篩選研究對ADPKD的早期檢測、病理過程闡述及減緩疾病進程非常必要。與ADPKD相關(guān)的代謝物主要包括上調(diào)的5-甲基-2′-脫氧胞苷、葡糖胺、(S)-2-甲基-1，4，5，6-四氫甲基嘧啶-4-羧酸(英文名ectoine)、尿囊酸鹽、α-羥基苯甲酸鹽、苯乙酰甘氨酸鹽和3-苯基丙酸鹽，以及下調(diào)的2-脫氧胞苷、癸酸和10-羥基癸酸[19]。Taylor等[20]研究發(fā)現(xiàn)了該疾病早期階段顯著改變的幾條生物代謝路徑，其中嘌呤代謝和半乳糖代謝最為顯著。另外，也篩選出尿囊酸和腺苷等ADPKD專屬性的潛在標(biāo)志物，這些標(biāo)志物及其代謝通路為建立非創(chuàng)傷性的ADPKD診斷方法，及新的治療手段帶來了新的希望。

1.7 在糖尿病腎病研究中的應(yīng)用 糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是末端腎病的主要原因。目前，微量蛋白尿是診斷糖尿病腎病唯一的非創(chuàng)傷性的標(biāo)志物。然而，有些病人檢測出微量蛋白尿時，腎臟已有很嚴(yán)重的病理學(xué)變化，這一階段的治療效果明顯差于疾病早期階段。因此，篩選能表征糖尿病腎病早期階段的生物標(biāo)志物非常有意義。Zhao等[21]對糖尿病大鼠腎上皮樣品做了代謝物組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一系列與糖尿病腎病相關(guān)的差異代謝物，包括氨基酸、碳水化合物、多元醇、溶血磷脂、葡萄糖醛酸苷以及多種無法鑒別的代謝物。其中，尿毒癥毒素、葡萄糖醛酸苷以及葡萄糖毒性有關(guān)的代謝物表達上調(diào)，并與24 h蛋白尿水平、腎小管間質(zhì)性損傷等糖尿病腎病損傷高度相關(guān)。Hirayama等[22]應(yīng)用血清代謝物組學(xué)分析鑒別了可用于糖尿病診斷的一系列生物標(biāo)志物。該研究發(fā)現(xiàn)，尿液中含有大分子蛋白尿和不含大分子蛋白尿的糖尿病病人有19種差異代謝物，包括肌酐、天冬氨酸、γ-丁基甜菜堿、瓜氨酸、二甲基精氨酸、犬尿素、壬二酸和半乳糖二酸。Han等[23]應(yīng)用基于GC-MS的代謝物組學(xué)方法，評價血漿中酯化脂肪酸和非酯化脂肪酸的水平，并將該方法應(yīng)用于150個糖尿病腎病病人的血漿分析，共鑒別了25個脂肪酸(包括酯化和非酯化的脂肪酸)，精確地測定了其中15種脂肪酸，并據(jù)此推測糖尿病腎病、糖尿病的病理機制與脂肪酸代謝之間的聯(lián)系。

1.8 在原發(fā)性腎低尿酸血癥研究中的應(yīng)用 原發(fā)性腎低尿酸血癥是一種不常見的腎病，主要特征為腎尿酸清除率增加，而這主要是由腎近端小管尿酸膜轉(zhuǎn)運先天缺陷導(dǎo)致。Tzovaras等[24]以基于磁共振技術(shù)的代謝物組學(xué)方法對原發(fā)性腎低尿酸血癥病人的尿液進行分析，以評價腎小管功能。在構(gòu)建的正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA)模型中，原發(fā)性腎低尿酸血癥病人與健康志愿者可明顯地區(qū)分開，區(qū)分性變量主要包括下調(diào)的馬尿酸鹽、肌酐、三甲胺-N-氧化物，以及上調(diào)的苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸、乙酸鹽和一個尚未鑒定的代謝物。

2 總結(jié)和展望

腎病種類多樣且病因復(fù)雜，可引起全身性內(nèi)環(huán)境紊亂。代謝物組學(xué)可以非靶標(biāo)地分析不同生物樣本中所有的小分子代謝物，是篩選生物標(biāo)志物的理想方法。本文分析了現(xiàn)存腎病標(biāo)志物的不足，并介紹了目前代謝物組學(xué)在腎病早期診斷及預(yù)后標(biāo)志物篩選中的應(yīng)用。代謝物組學(xué)篩選的生物標(biāo)志物較傳統(tǒng)的臨床生化和組織病理學(xué)方法能更早地檢測腎病的發(fā)生、發(fā)展。因此，經(jīng)濟、快速、高通量的代謝物組學(xué)技術(shù)在腎病的個體化診斷及治療領(lǐng)域顯示出巨大的潛力和價值。然而，代謝物組學(xué)也存在一些不足之處。(1)由于代謝產(chǎn)物具有不均一性，相對分子質(zhì)量、極性、揮發(fā)性、豐度均有差異；(2)代謝物組學(xué)平臺建立的前處理及后續(xù)的分離檢測方法無法完全覆蓋所有的內(nèi)源性代謝物；(3)后續(xù)的原始數(shù)據(jù)處理和信息挖掘也有待進一步改進；(4)單獨依靠代謝物組學(xué)并不能完全闡述疾病進程中的生化異常。因此，今后的腎病代謝物組學(xué)研究必須首先優(yōu)化代謝物組學(xué)分析平臺，改善前處理和分離檢測手段，發(fā)展更為先進的數(shù)據(jù)預(yù)處理及信息挖掘手段；其次聯(lián)合系統(tǒng)生物學(xué)中的其他組學(xué)技術(shù)，全面詳細闡述疾病過程中的生化異常。代謝物組學(xué)的發(fā)展增加了人們對疾病的認識，其與基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等結(jié)合對疾病機制進行科學(xué)闡述將是今后研究的熱點[25]。

總而言之，在代謝物水平上全面表征腎病有助于更好地闡釋腎病的發(fā)病機制，篩選更可靠的生物標(biāo)志物用于診斷及個體化治療。代謝物組學(xué)技術(shù)不但解決了以往自上而下的研究模式(從基因編碼到轉(zhuǎn)錄修飾再到蛋白質(zhì)表達)面臨的挑戰(zhàn)，即如何準(zhǔn)確闡述組學(xué)數(shù)據(jù)的生物功能與臨床現(xiàn)象的相關(guān)性問題，而且代謝物組學(xué)與代謝表型最為相關(guān)，對基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)做了很好的補充，從系統(tǒng)生物學(xué)的下游(小分子代謝物)出發(fā)，為腎病研究提供了新思路和新希望。然而，目前代謝物組學(xué)在腎病研究中的應(yīng)用仍處于起步階段，主要停留在生物標(biāo)志物的初步篩選，在后續(xù)工作中必須對篩選到的生物標(biāo)志物做進一步驗證，最終應(yīng)用于臨床疾病的早期診斷及治療干預(yù)，從而在腎病研究中發(fā)揮更大的優(yōu)勢。

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