宋韶錦，劉華麗，丁平田

（1.威海市藥品檢驗(yàn)所，山東威海264200；2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016）

·制劑研究·

石杉堿甲－玉米醇溶蛋白微球釋放特性的研究

宋韶錦1，劉華麗2，丁平田2

（1.威海市藥品檢驗(yàn)所，山東威海264200；2.沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽110016）

目的建立石杉堿甲－玉米醇溶蛋白微球體外釋放的測定方法，并考察載藥微球的體外釋放特性及影響因素。方法采用高效液相色譜法，色譜條件：色譜柱：ODS－C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：pH 2.5磷酸鹽緩沖液－乙腈（86∶14，V／V）；檢測波長：310 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。將石杉堿甲載藥微球加以不同的釋放介質(zhì)，在搖床中振蕩，定時(shí)取樣并補(bǔ)以新鮮介質(zhì)，高效液相色譜法測定石杉堿甲的累積釋放率，并用不同釋藥模型對水為介質(zhì)的釋放結(jié)果進(jìn)行擬合。結(jié)果建立的高效液相色譜法符合方法學(xué)要求，分別以零級、一級、Higuchi以及Ritger－Peppas方程對以水為介質(zhì)的釋藥曲線進(jìn)行擬合，相關(guān)系數(shù)分別為0.693 8、

高效液相色譜法；玉米醇溶蛋白；微球；體外釋放

石杉堿甲［1］（Huperzine A，HupA）是由石杉科植物千層塔中提取的一種生物堿，是現(xiàn)在臨床上較常使用的膽堿酯酶抑制劑，主要用于治療重癥肌無力、血管性癡呆、阿爾茨海默癥及良性記憶衰退。玉米醇溶蛋白［2，3］（Zein）提取自玉米，為一種安全無毒，生物相容性和生物降解性良好的天然材料，其較強(qiáng)的疏水性是減緩藥物釋放的一個(gè)重要因素。以玉米醇溶蛋白為載體的石杉堿甲微球有望降低藥物的日給藥次數(shù)，減少血藥濃度波動(dòng)，還可改善吞咽困難，記憶力差難以按時(shí)服藥的老年癡呆患者的用藥順應(yīng)性。本文建立了一種可靠的石杉堿甲—玉米醇溶蛋白微球體外釋放實(shí)驗(yàn)測定方法，對載藥微球的體外釋

放特性進(jìn)行了初步研究，考察了影響其體外釋放的因素，并對體外釋放實(shí)驗(yàn)中藥物從載藥微球中釋放可能依從的釋藥模型以及釋放機(jī)制進(jìn)行了分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 高效液相色譜儀（SPD－10A VP檢測器，LC10－ATVP泵，日本島津公司）；HW2000色譜工作站（上海千譜軟件有限公司）；BS 110 S型分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ－50B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ－Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；WFZ UV 4802H紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯儀器有限公司）；恒溫氣浴振蕩器（天津市歐諾儀器有限公司）；pH－3C型酸度計(jì)（上海偉業(yè)儀器廠）。

1.2 試劑 玉米醇溶蛋白（江蘇高郵市日星藥用輔料有限公司）；石杉堿甲原料藥（批號：100604；浙江萬邦藥業(yè)有限公司）；無水乙醇（分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司）；乙腈（色譜純天津市康科德科技有限公司）；甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；磷酸二氫鉀（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（遼寧嘉誠精細(xì)化學(xué)品有限公司）；其他試劑皆為分析純，水為去離子水。

2 方法

2.1 HPLC色譜條件［4］色譜柱：ODS－C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相：pH 2.5磷酸鹽緩沖液－乙腈（86∶14，V／V）；檢測波長：310 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 方法專屬性 取空白微球溶液、載藥微球釋放以及石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進(jìn)樣20μL，記錄HPLC色譜圖。

結(jié)果如圖1所示，石杉堿甲的保留時(shí)間為7.9 min，理論塔板數(shù)為13 403，不對稱因子1.05，在測定條件下，空白微球材料等因素不干擾石杉堿甲釋放的測定。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取10 mg石杉堿甲至100 mL容量瓶中，少量甲醇溶解后以水為溶劑稀釋，制備濃度分別為1、2、5、10、20 g·mL－1的石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC法測定主峰面積，每次進(jìn)樣20μL，記錄HPLC色譜圖。

表1 石杉堿甲標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度及峰面積

以濃度和峰面積做線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：A＝35 953C－1 239.3，r＝0.999 9，可見在1～20μg·mL－1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 HPLC色譜圖A.空白微球；B.石杉堿甲載藥微球；C.石杉堿甲

2.4 回收率 精密稱取10 mg空白微球于10 mL容量瓶中，分別加入濃度為1、5、10 g·mL－1的石杉堿甲溶液定容，過濾，HPLC測定藥物含量，計(jì)算回收率。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）

結(jié)果表明，低、中、高3組濃度的藥物溶液回收率均在98%與102%之間，符合方法學(xué)回收率要求。

2.5 精密度 取濃度為10 g·mL－1石杉堿甲溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄HPLC色譜圖，計(jì)算日內(nèi)精密度。

表3 日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

結(jié)果表明，RSD小于2%，精密度良好，符合方法學(xué)要求。

2.6 溶液穩(wěn)定性 將10 g·mL－1樣品室溫下放置，于0、1、6、12、24、48 h進(jìn)樣，記錄HPLC色譜圖。

表4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

結(jié)果表明，石杉堿甲水溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 體外釋放實(shí)驗(yàn)方法 精密稱取10 mg石杉堿甲載藥微球，加以100 mL釋放介質(zhì)，置于搖床中，振蕩轉(zhuǎn)速為50 rpm。定時(shí)取樣5 mL并補(bǔ)充新鮮介質(zhì)，HPLC測定石杉堿甲濃度。

藥物的累積釋放率計(jì)算公式如下：

式中，Er－石杉堿甲累積釋放率，%；Ve－水的置換體積，5 mL；V0－釋放介質(zhì)水的總體積，100 mL；Ci－第i次置換取樣時(shí)釋放液中的藥物濃度，μg·L－1；Cn－第n次置換取樣時(shí)釋放液中的藥物濃度，μg·L－1；Mdrug－用于釋放的藥量，μg。

3 體外釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 釋藥機(jī)理研究 以水為釋放介質(zhì)，載藥微球的釋放曲線如圖2所示。

圖2 石杉堿甲載藥微球在水中的釋放結(jié)果

通過石杉堿甲載藥微球體外釋放曲線可以看出，藥物呈現(xiàn)出緩釋釋藥特征，1 h平均釋放26.3%，12 h平均累積釋放88.4%。分別對釋藥曲線進(jìn)行零級、一級、Higuchi方程以及Ritger－Peppas方程擬合，擬合相關(guān)系數(shù)越大，表明藥物釋放動(dòng)力學(xué)越接近該釋藥模型，各方程擬合結(jié)果見表5。

表5 不同數(shù)學(xué)模型擬合石杉堿甲微球體外釋放的相關(guān)系數(shù)

結(jié)果表明Higuchi方程擬合相關(guān)系數(shù)最大，認(rèn)為石杉堿甲載藥微球體外釋藥模型為Higuchi模型。Ritger－Peppas方程中n＝0.41，小于臨界值0.45，認(rèn)為擴(kuò)散為藥物的主要釋放機(jī)制。

3.2 pH的影響 選擇釋放介質(zhì)為pH 1.0 HCl溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和去離子水，分別考察pH對藥物釋放的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同pH條件下石杉堿甲從微球中的釋放結(jié)果

石杉堿甲在上述4種介質(zhì)中表現(xiàn)出不同的釋藥曲線，在pH 1的介質(zhì)中釋放最快，累積釋放率最大，1 h累積釋放34%，4 h為89%，24 h接近100%。在水中的釋放次之，2 h累積釋放38.4%，12 h釋放90.6%。而在pH 4.5和pH 6.8的介質(zhì)中釋放慢于水，考慮是由于介質(zhì)中離子強(qiáng)度的影響。

3.3 離子強(qiáng)度的影響 分別配制NaCl濃度為0.01、0.1、0.2、0.5和1 mol·L－1的水溶液，考察離子強(qiáng)度對微球體外釋藥的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同離子強(qiáng)度條件下石杉堿甲載藥微球在水中的釋放結(jié)果

介質(zhì)的離子強(qiáng)度對藥物釋放有明顯影響，離子強(qiáng)度越高對藥物釋放的影響越大。0.01 mol·L－1NaCl水溶液中微球釋放與在純水介質(zhì)中差異不大。增大NaCl濃度，藥物釋放減慢，24 h內(nèi)藥物的累積釋放量減少。當(dāng)NaCl濃度為1 mol·L－1時(shí)，藥物釋放呈現(xiàn)為零級釋藥曲線。

4 討論

本文對石杉堿甲載藥微球進(jìn)行體外釋放考察，介質(zhì)的pH和離子強(qiáng)度均影響藥物的體外釋放。低pH下藥物釋放最快，主要是由于石杉堿甲為弱堿性藥物，在低pH條件下溶解度更高。pH 6.8的介質(zhì)和純水介質(zhì)的pH差別不大，但在pH 6.8 PBS中釋放更慢，則考慮是離子強(qiáng)度不同所致，這可以從對不同離子強(qiáng)度條件下載藥微球的體外釋放的考察結(jié)果中得到解釋。考察不同離子強(qiáng)度的水介質(zhì)對藥物釋放的影響，1 mol·L－1NaCl水溶液釋放最慢，0～24 h內(nèi)呈零級釋藥模型。離子強(qiáng)度越高，微球的水分?jǐn)z取過程受到限制，微球材料zein的疏水性相對更強(qiáng)，從而使得藥物釋放減慢。在高離子強(qiáng)度下，藥物從zein微球中釋放減慢的現(xiàn)象在文獻(xiàn)中亦有報(bào)道［5］。Higuchi方程一般用于描述不溶性骨架中藥物的擴(kuò)散過程，主要包括3個(gè)階段：水分滲透進(jìn)入微球骨架內(nèi)部；石杉堿甲溶解形成溶液；藥物從骨架內(nèi)擴(kuò)散進(jìn)入外部水溶液。影響微球體外釋放的因素［6］包括水分的攝取、藥物的溶出速率、微球粒徑及骨架的溶蝕或降解速率。對石杉堿甲載藥微球在水中的釋藥機(jī)制進(jìn)行研究，zein不溶于水，使得微球在整個(gè)釋放時(shí)間內(nèi)不發(fā)生降解，其疏水性阻礙水分的攝取，因而會(huì)減慢藥物的釋放，藥物通過骨架的擴(kuò)散過程為藥物釋放的限速步驟。Ritger－Peppas方程中k為0.41，小于臨界值0.45，進(jìn)一步證明了擴(kuò)散為藥物的釋放機(jī)理。

在體外釋放實(shí)驗(yàn)中，zein未保持獨(dú)立分散的單個(gè)微球狀態(tài)，而是幾個(gè)微球之間相互聚集。這種zein微球在釋放過程中的聚集現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中均有報(bào)道［7］，此聚集與微球粒徑大小無關(guān)，而是與介質(zhì)pH有關(guān)。Zein等電點(diǎn)PI約為6.8［8］，在水中幾乎不帶電荷，因其具備較強(qiáng)的疏水性，使得微球間會(huì)通過聚集來減少蛋白在水中的表面積以減少蛋白與水之間的自由能。

［1］劉小林，程春榮，曹威，等.石杉堿甲的藥理作用與臨床應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2006，25（2）：90－95.

［2］常亮，韓恩山，胡建修，等.玉米醇溶蛋白的研究及應(yīng)用［J］.化工中間體，2006，1：10－12.

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［4］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典2010年版（二部）［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：110.

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［7］Regier MC.Zein nanospheres for gene delivery［D］.Lincoln：University of Nebraska－Lincoln，2011.

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Study on in vitro release of Huperzine A Loaded Zein Microspheres

SONG Shao-jin1，LIU Hua-li2，DING Ping-tian2
（1．Weihai Institute for Drug Control，Weihai264200，China；2．Shenyang School of Pharmacy Pharmaceutical University，Shenyang 110016，China）

ObjectiveThe purpose of this study was to research the property and effect factors of the release of huperzine－zein microspheres in vitro.MethodsAn HPLC method was established to measure the concentration of HupA in the samples.The release of huperzine A－zein microspheres in vitro was test in different mediums with a shaking table and the samples were extracted at definite times.Several models were used to fit the release result to speculate the release mechanism.ResultsThe established method would be applied for the study of the in vitro release.The correlation value r of zero order，first order，Higuchi and Rigter－Peppas was0.693 8，0.902 5，0.964 6 and 0.954 7，respectively.The release rate of HupA from the microspheres was different when pH and the ionic strength changes.ConclusionThe release mechanism of HupA－zein microspheres was most corresponded with Higuchi model.The result showed that HupA mainly diffuses from the microspheres.The pH value and ionic strength would affect the release rate of HupA due to the variations of the solubility of HupA and the relative hydrophobicity of zein respectively.

HPLC；Zein；Microsphere；In vitro release

R944.9

A

2095－5375（2014）01－0027－004

宋韶錦，女，研究方向：藥物分析，E－mail：whsyjs＠sina.com

0.902 5 、0.964 6和0.954 7。介質(zhì)的pH和離子強(qiáng)度不同，藥物的釋放結(jié)果不同。結(jié)論石杉堿甲－玉米醇溶蛋白微球在水中的釋放符合Higuchi模型，微球中藥物的釋放機(jī)制以擴(kuò)散為主。不同的pH和離子強(qiáng)度主要是分別通過影響石杉堿甲的溶解度和玉米醇溶蛋白的相對疏水性來影響石杉堿甲從微球中的釋放速率。