褐牙鲆、夏鲆及其雜交子代核型與DAPI帶型分析

隋 娟, 馬道遠(yuǎn), 肖志忠, 徐世宏, 肖永雙,, 武寧寧, 劉清華, 李 軍

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所(南通)海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 江蘇 南通, 226000; 3. 青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站, 山東 青島, 266071)

褐牙鲆、夏鲆及其雜交子代核型與DAPI帶型分析

隋 娟1, 馬道遠(yuǎn)1, 肖志忠1, 徐世宏1, 肖永雙1,2, 武寧寧3, 劉清華1, 李 軍1

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島, 266071; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所(南通)海洋科學(xué)與技術(shù)研究發(fā)展中心, 江蘇 南通, 226000; 3. 青島市漁業(yè)技術(shù)推廣站, 山東 青島, 266071)

為了深入剖析褐牙鲆與夏鲆雜交后代的染色體結(jié)構(gòu), 本研究利用秋水仙素-低滲-空氣干燥法制備胚胎染色體和 DAPI (4’, 6’-diamidino-2-phenylindole) 熒光染色的方法, 對褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)、夏鲆(Paralichthys dentatus)及其正反交子代胚胎細(xì)胞的染色體組型和染色質(zhì)的分布進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 褐牙鲆、夏鲆及其正交子代(褐牙鲆♀ × 夏鲆♂)染色體組均含有48條端部著絲粒染色體, 染色體組型公式均為2n=48t, 組內(nèi)染色體長度分布連續(xù), 三者核型相似。反交子代(夏鲆♀ × 褐牙鲆♂)為46條端部著絲粒染色體, 比親本及正交子代少了兩條染色體。DAPI熒光染色顯示, 褐牙鲆1號染色體中的一條染色體有較明顯的次縊痕, 夏鲆及正反交子代染色體中未見明顯次縊痕。褐牙鲆與正交子代染色體著色較為均一, 而夏鲆與反交子代著絲粒區(qū)域亮度明顯增強。

褐牙鲆(Paralichthys olivaceus); 夏鲆(Paralichthys dentatus); 雜交; 核型; DAPI帶型

褐牙鲆(Paralichthys olivaceu)與夏鲆(Paralichthys dentatus)同屬于牙鲆科(Paralichthidae)牙鲆屬(Paralichthys)。褐牙鲆是優(yōu)良的海水養(yǎng)殖種之一,在中國、韓國、日本沿海均有大規(guī)模養(yǎng)殖。褐牙鲆最適生長溫度較低, 夏季養(yǎng)殖水溫超過24℃易造成停食和死亡現(xiàn)象, 影響了褐牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展; 夏鲆又稱夏牙鲆、大西洋牙鲆、犬齒牙鲆等, 主要分布于北美洲大西洋沿岸, 具有生長快、產(chǎn)量高、肉質(zhì)好、耐高溫等優(yōu)點。中國2002年引種成功, 但夏鲆最適生長溫度較高, 在北方不易越冬[1]。雜交育種技術(shù)是新品種開發(fā)的有效途徑, 也是魚類抗逆品種選育的有效方法。鑒于兩種魚類經(jīng)濟(jì)性狀互補,通過遠(yuǎn)緣雜交有可能篩選出綜合雙親優(yōu)勢的后代,為中國牙鲆養(yǎng)殖品種的改良提供新的途徑。目前,褐牙鲆和夏鲆雜交后代的受精細(xì)胞學(xué)[2]、早期發(fā)育[3-5]、DNA 遺傳特征[6]等方面的研究成果已相繼報道。細(xì)胞遺傳學(xué)相關(guān)研究也已展開, 結(jié)果顯示褐牙鲆、夏鲆及其正交子代(褐牙鲆♀ × 夏鲆♂)染色體均為端部著絲粒染色體, 核型為 2n=48t[6], 染色體相對長度[7-8]及褐牙鲆DAPI帶型[9]也有相關(guān)報道,但至今仍未見夏鲆及正反交子代DAPI帶型的相關(guān)研究。

核型分析具有直觀、形象的優(yōu)勢, 是雜交后代遺傳分析的常用方法[10]。帶型是對染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行精細(xì)分析的研究, 能精確地辨認(rèn)染色體地結(jié)構(gòu)變化。熒光染料DAPI 可揭示染色體上AT富含的區(qū)域, 經(jīng) DAPI 等染料染色后染色體上會顯示明顯不同的深染區(qū)和淺染區(qū), 可以特異性地顯示不同生物體中異染色質(zhì)的存在區(qū)域[11]。迄今, DAPI帶型在大麥(Hordeum vulgareL.)[12]、蕹菜(Ipomoea aquanticaForsk)[13]等植物以及瀨魚(Steindachneridionsp.,Rhamdia quelen)[14]、河豚(Tetraodon fluviatilis)[15]、鳙魚(Aristichthys nobilis)[16]、櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[17]等動物染色體研究中進(jìn)行了相關(guān)報道, 在細(xì)胞遺傳學(xué)研究中顯示出重要的意義。

本研究擬對褐牙鲆、夏鲆及其雜交子代的染色體組型及 DAPI帶型展開研究, 為剖析褐牙鲆與夏鲆及其雜交后代的染色體結(jié)構(gòu)提供細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù), 從而為更合理、有效地開發(fā)利用雜種優(yōu)勢奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用褐牙鲆、夏鲆、正交子代(褐牙鲆♀ ×夏鲆♂, Fo)及反交子代(夏鲆♀ × 褐牙鲆♂, Fr)取自青島薛家島養(yǎng)殖場。各組合進(jìn)行受精后, 取受精率大于 80%的受精卵進(jìn)行染色體制片。先后3批次取出囊胚、原腸時期的受精卵1000粒, 每批次中再取出優(yōu)質(zhì)受精卵100～200粒進(jìn)行實驗。

1.2 實驗方法

1.2.1 魚類胚胎染色體的制備

使用海水配制的 0.02%秋水仙素處理 30 min, 0.075 mol/L KCl進(jìn)行低滲, 時間1 h。新配制的卡諾固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)進(jìn)行固定, 每 15 min更換一次固定液, 共3次, -20℃冰箱中保存。用一次性滴管吸取少許固定好的胚胎放到離心管中, 加50%的醋酸溶液解離細(xì)胞20～30 min。由于受精卵卵殼堅韌, 用寬頭鑷子將卵膜打破, 將胚胎細(xì)胞和卵黃擠出, 再用吸管吹吸, 使胚胎細(xì)胞充分分散成懸液, 熱滴片?？諝飧稍锓ǜ稍锖? 用 15%吉姆薩染液染色10 min, 流水沖洗多余的吉姆薩染液后進(jìn)行鏡檢, 每種樣品計數(shù)分裂相100個。

1.2.2 核型分析方法

取有絲分裂中期分裂相, 測量染色體的相對長度, 計算臂比率(長臂/短臂)。染色體的編號及類型的確定按 Levan等[18]報道的方法進(jìn)行。以字母M表示中部著絲粒染色體, SM表示亞中部染色體, ST為亞端部著絲粒染色體, T為端部染色體。

1.2.3 DAPI熒光染色及觀察

在暗室內(nèi)按每張30 μL DAPI(0.15 μg/mL)滴在鏡檢過的染色體制片上, 蓋上蓋玻片, Nicon 50i熒光顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 褐牙鲆、夏鲆及正反交子代染色體計數(shù)及核型分析

褐牙鲆、夏鲆及正交子代Fo的染色體眾數(shù)為48,反交子代Fr的染色體眾數(shù)為46, 與親本相比, 缺失了兩條染色體(表1)。

按 Levan等的標(biāo)準(zhǔn)對褐牙鲆、夏鲆及正交子代的染色體進(jìn)行排列、編號, 它們的核型公式為 K(2n)= 48t。48條染色體長度分布均勻、形態(tài)相似, 彼此很難區(qū)別(表2)。

表1 褐牙鲆、夏鲆及正反交子代染色體數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果Tab. 1 Chromosome count results in the P. olivaceus, P. denlalus and their hybrids

2.2 DAPI染色的觀察結(jié)果

圖1～圖4顯示, 褐牙鲆、夏鲆及其正反交子代的染色體上, 明亮區(qū)域主要集中在著絲粒部位, 幾乎所有的染色體著絲粒區(qū)域顯示 DAPI帶, 未發(fā)現(xiàn)在末端區(qū)和中間區(qū)。但褐牙鲆與正交鲆在著絲粒區(qū)的亮度增強不明顯, 而夏鲆與反交鲆的染色體在著絲粒區(qū)的亮度有明顯增強。

圖1 褐牙鲆DAPI帶型(箭頭所示為1號染色體)Fig. 1 DAPI karyotype of P. olivaceus (Arrow indicates chromosome 1)

圖2 夏鲆DAPI帶型Fig. 2 DAPI karyotype of P. dentatus

圖3 正交鲆DAPI帶型Fig. 3 DAPI karyotype of the original hybrids (P. olivaceus♀× P. dentatus ♂)

表2 褐牙鲆、夏鲆及正交鲆核型分析結(jié)果Tab. 2 Karyotype analysis of P. olivaceus, P. dentatus and the original hybrids of P. olivaceus ♀× P. dentatus♂ (Fo)

圖4 反交鲆的DAPI帶型Fig. 4 DAPI karyotype of the reciprocal hybrids (P. dentatus♀× P. olivaceus ♂)

3 討論

3.1 褐牙鲆、夏鲆及正反交子代的染色體組型

關(guān)于褐牙鲆染色體數(shù)量和組型已有許多研究報道[7-9,19]。Fujiwara等[9]通過不同染色方法發(fā)現(xiàn), 褐牙鲆1號染色體距著絲粒一端1/3處有較明顯的次縊痕,本研究只在 1號同源染色體中的一條染色體距著絲粒一端 1/3處發(fā)現(xiàn)有較明顯的次縊痕, 尚需結(jié)合銀染、CMA3等染色方法做進(jìn)一步驗證。次縊痕是染色體上的一個縊縮部位, 由于此處部分的 DNA松懈,形成核仁組織區(qū), 故此變細(xì)。它的數(shù)量、位置和大小是染色體的重要形態(tài)特征。

核型類似是近緣物種間能夠雜交的基礎(chǔ), 本研究中的褐牙鲆和夏鲆核型均為 2n=48t。如果染色體數(shù)目或核型相差太大, 有可能導(dǎo)致精核與卵核融合后染色體不能正常配對進(jìn)行細(xì)胞分裂[20-21]。根據(jù)作者的實驗結(jié)果, 正交組合可以得到活力正常的后代,而反交組合的后代在孵化后脊柱彎曲, 體態(tài)異常,幾天內(nèi)便全部死亡。染色體計數(shù)分析發(fā)現(xiàn)正交的染色體核型為 2n=48t, 與親本的核型一致; 反交的染色體核型為2n=46t, 相比于親本丟失了兩條染色體。該結(jié)果與Xu等[6]的研究結(jié)果一致。

魚類遠(yuǎn)緣雜交結(jié)果比較復(fù)雜, 雜交 F1中親本染

色體可能部分或全部被排除, 也可能同時含有雙親完整基因組。鰱(Hypophthalmichthys molitrix)♀×鯉(Cyprinus carpio) ♂、鰱♀×鯽(Carassius auratus) ♂和鰱♀×白鯽(C. auratus cuvieri)♂的雜種胚胎中都出現(xiàn)染色體丟失的現(xiàn)象, 雜種基本上是非整倍體[22];馬蘇大麻哈魚(Oncorhynchus masou)♀×虹鱒(O.mykiss) ♂雜交子代在發(fā)育過程中選擇性丟失父本染色體[23]; 大黃魚(Pseudosciaena crocea)♀× (Miichthys miiuy) ♂雜交子代為異精雌核發(fā)育個體[24]。許多研究者認(rèn)為染色體丟失是由于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的不相容引起的: 母體卵細(xì)胞質(zhì)控制雜種胚胎基因表達(dá)的遲滯或加速。如果卵子的細(xì)胞質(zhì)不能與精子的核 DNA正常協(xié)調(diào)(不相容), 就會阻滯或加速基因的表達(dá)[20-22]。受精細(xì)胞學(xué)證據(jù)顯示, 夏鲆卵子與褐牙鲆精子受精后, 精卵原核的融合時間比親本組合及正交組合有明顯的延長, 暗示夏鲆卵子與褐牙鲆精子存在某種程度的不融合現(xiàn)象[2]。由于褐牙鲆、夏鲆及其雜交子代的染色體結(jié)構(gòu)及組型差異不明顯, 根據(jù)核型以及 DAPI帶型分析結(jié)果沒有找到可以區(qū)別兩親本的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。要研究反交鲆丟失的染色體為隨機丟失還是選擇性丟失, 需要采用更精細(xì)的分析方法。

3.2 褐牙鲆、夏鲆及正反交子代染色體上異染色質(zhì)的分布

核型類型的相似性, 反映了褐牙鲆和夏鲆在進(jìn)化上的趨同性和變異性, 同時也表明細(xì)胞水平的核型還是不能充分反映不同的物種的差異, 需要進(jìn)一步通過帶型分析來進(jìn)行區(qū)分。DAPI是一種雙鏈DNA 特異的染料, 與 DNA作用至少有兩種不同的機制[25], 在AT堿基對富有區(qū)域, DAPI與DNA雙鏈的小溝結(jié)合, 其結(jié)合量大而發(fā)出較強的熒光, 而在GC 富有區(qū)域, DAPI則插入雙鏈的堿基之間而產(chǎn)生較弱的熒光或不發(fā)熒光, 而富含AT堿基對的區(qū)域也就是重復(fù)順序含量高的異染色質(zhì)區(qū)域[26]。作者的實驗結(jié)果表明, 褐牙鲆、夏鲆及其正反交子代染色體上明亮區(qū)域主要集中在著絲粒部位, 除著絲粒區(qū)域外,不同染色體的熒光強度無明顯差別, 與褐牙鲆[18]及鳙魚[12]中的DAPI結(jié)果類似, 但鳙魚中第1和第4染色體的短臂上也發(fā)現(xiàn)有高亮區(qū)域, 可能體現(xiàn)了不同種間染色體結(jié)構(gòu)的差別。

在染色體的觀察中作者也發(fā)現(xiàn)褐牙鲆與正交鲆在著絲粒區(qū)的亮度增強不明顯, 而夏鲆與反交鲆的染色體在著絲粒區(qū)的亮度有明顯增強, 可以推測褐牙鲆與正交鲆染色體著絲粒上富含 AT 堿基對的區(qū)域相對可能較少, AT堿基可能是散布的, 而夏鲆與反交鲆染色體著絲粒上富含 AT 堿基對的區(qū)域相對可能較多, AT堿基可能是呈簇分布的。褐牙鲆與正交鲆以及夏鲆與反交鲆在 DAPI帶型上的相似性具有較強的偏母遺傳特征。是否富含AT堿基對的異染色質(zhì)區(qū)域遵守母性遺傳仍有待進(jìn)一步研究驗證。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Karyotypes and DAPI staining ofParalichthys olivaceus,Paralichthys dentatusand their hybrids

SUI Juan1, MA Dao-yuan1, XIAO Zhi-zhong1, XU Shi-hong1, XIAO Yong-shuang1,2, WU Ning-ning3, LIU Qing-hua1, LI Jun1
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Nantong Branch, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Marine Science and Technology Research and Development Center, Nantong 226000, China; 3. Qingdao Fishery Technique Promotion Station, Qingdao 266071, China )

Aug., 14, 2013

Paralichthys olivaceus;Paralichthys dentatus; hybridization; karyotype; DAPI banding

In order to study the chromosomal structure of the interspecific hybrids betweenP. olivaceusandP. dentatus, the chromosomes were obtained from the embryos ofParalichthys olivaceus,Paralichthys dentatusand their reciprocal crosses were prepared using Colchine-hypotonic-air drying methods and stained with gluorescence dye DAPI (4’, 6’-diamidino-2-phenylindole). The results showed thatP. olivaceus,P. dentatusand the original hybrids (P. olivaceus♀ ×P. dentatus♂, Fo) were consisted of 48 telocentromerie chromosomes and their karyotype formula was 2n= 48t, with continuous length intragenomes and similar karyotype. Two chromosomes were missing in the reciprocal hybrids (P. dentatus♀ ×P. olivaceus♂, Fr). The DAPI banding patterns showed that the distinctive secondary constriction was assigned to one homologue of chromosome 1 inP. olivaceus. The chromosomes were all uniformly stained inP. olivaceusand Fo, except strongly positive staining at the centromere of all chromosomes inP. dentatusand Fr.

S917

A

1000-3096(2014)03-0069-06

10.11759/hykx20130814004

2013-08-14;

2013-11-26

國家鲆鰈類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項目(nycytx-50); 中國科學(xué)院創(chuàng)新項目(KSC2-EW-B-3); 中國科學(xué)院重點部署項目(KSCX2-EW-B-14); 山東省科技發(fā)展計劃資助項目(2011GHY11530); 江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(BK2012222); 青島市科技計劃資助項目(12-4-1-51-hy); 青島市科技計劃基礎(chǔ)研究項目(12-1-4-8(6)-jch)

隋娟(1984-), 女, 博士, 主要從事海洋動物遺傳育種學(xué)研究, E-mail: suijuan0313@126.com; 李軍, 通信作者, 研究員, E-mail: junli@ qdio.ac.cn; 劉清華, 通信作者, 副研究員, E-mail: qinghualiu@qdio.ac.cn