龐甲佩，逄建勇，胥國(guó)立，解福生

（1.山東阿華生物藥業(yè)有限公司，山東東阿252201；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東東阿252201）

HPLC法測(cè)定PEG－EPO中丁二酰亞胺的殘留量

龐甲佩1，2，逄建勇1，2，胥國(guó)立1，2，解福生1，2

（1.山東阿華生物藥業(yè)有限公司，山東東阿252201；2.山東東阿阿膠股份有限公司，山東東阿252201）

目的建立聚乙二醇重組人促紅素（PEG－EPO）中丁二酰亞胺殘留量測(cè)定的高效液相色譜法。方法使用高效液相色譜法，色譜柱為Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相為0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5），檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為0.7 mL·min－1。結(jié)果線性范圍為0.08～0.8μg（r＝1），6次重復(fù)進(jìn)樣峰面積響應(yīng)值的RSD為0.61%，平均加樣回收率為100.96%。結(jié)論建立的高效液相色譜法簡(jiǎn)單、精密度良好、準(zhǔn)確度良好，可用于PEG－EPO中丁二酰亞胺殘留量檢測(cè)。

聚乙二醇重組人促紅素；丁二酰亞胺；高效液相色譜

人促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一種激素類糖蛋白，相對(duì)分子量為30 kD，它的功能是促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增殖，使之分化為成熟的紅細(xì)胞［1］。重組人促紅素（rhEPO）是通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)EPO，使之成本更低廉，質(zhì)量更穩(wěn)定。臨床上重組人促紅素主要應(yīng)用于治療腎功能不全所致貧血［2］和外科圍術(shù)期的紅細(xì)胞動(dòng)員［3］等，治療效果非常明顯。

重組人促紅素在人體內(nèi)循環(huán)半衰期較短，臨床每周注射3次。用甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺丁酸酯（mPEG－SBA）對(duì)重組人促紅素進(jìn)行修飾，兩者通過(guò)穩(wěn)定的共價(jià)鍵結(jié)合形成聚乙二醇重組人促紅素（PEG－EPO）［4］。PEG－EPO在生物體內(nèi)無(wú)毒性，減緩重組人促紅素在體內(nèi)降解速度，延長(zhǎng)重組人促紅素的半衰期，減少注射次數(shù)至每?jī)芍?次，減輕病人痛苦，并保證了藥效。

在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件下，mPEG－SBA和EPO的N末端α－氨基或賴氨酸ε－氨基反應(yīng)生成mPEG－EPO及丁二酰亞胺。反應(yīng)式如下：

丁二酰亞胺有一定毒性，為反應(yīng)副產(chǎn)物，為了更好地控制藥品的質(zhì)量，應(yīng)當(dāng)被去除［5］。丁二酰亞胺作為親水化合物和極性化合物，在常規(guī)C18柱中的保留能力很弱甚至根本不能保留，C18AQ色譜柱是專為親水性和極性化合物具有更強(qiáng)的保留能力和選擇性而設(shè)計(jì)的。本實(shí)驗(yàn)利用C18AQ色譜柱進(jìn)行高效液相層析，可以實(shí)現(xiàn)丁二酰亞胺、PEG－EPO的分離，從而可以檢測(cè)目的產(chǎn)物中丁二酰亞胺殘留量，以更好地控制藥品的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695－2996高效液相色譜儀，Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，KQ－800KDE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥 丁二酰亞胺（上海達(dá)瑞精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：20120426）；KH2PO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110304）；mPEG－SBA（北京鍵凱科技有限公司，批號(hào)：ZZ079P105）；rhEPO和PEG－EPO（本公司自制）；其他為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：0.02mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：0.7 mL·min－1；柱溫：（30±5）℃。

2.2 溶液制備

2.2.1 丁二酰亞胺對(duì)照品溶液（0.04 mg·mL－1）

準(zhǔn)確稱取減壓干燥至恒重的丁二酰亞胺（分子式C4H5NO3，分子量115.09）4.0 mg，用注射用水溶解定容至100 mL的容量瓶中，混勻，備用。

2.2.2 mPEG－SBA對(duì)照品溶液（3.0 mg·mL－1）

準(zhǔn)確稱取減壓干燥至恒重的mPEG－SBA（分子量30 000）0.030 g，用注射用水溶解定容至10 mL的容量瓶中，混勻，備用。

2.2.3 mPEG－SBA和rhEPO反應(yīng)溶液 按rhEPO∶mPEG－SBA質(zhì)量比1∶5，準(zhǔn)確稱取減壓干燥至恒重的mPEG－SBA，加入到rhEPO原液中，攪拌溶解，室溫下攪拌反應(yīng)2 h，用乙酸調(diào)pH 5.0，終止反應(yīng)，備用。2.2.4 供試品溶液 取PEG－EPO直接進(jìn)樣。

3 結(jié)果

3.1 專屬性考察 分別取制備的丁二酰亞胺對(duì)照品溶液、mPEG－SBA對(duì)照品溶液、mPEG－SBA和rhEPO反應(yīng)溶液、PEG－EPO供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。從色譜圖可見，丁二酰亞胺對(duì)照品溶液保留時(shí)間為7.3 min（見圖1）。mPEG－SBA對(duì)照品溶液在丁二酰亞胺位置處無(wú)吸收峰（見圖2），說(shuō)明mPEG－SBA性質(zhì)穩(wěn)定，未發(fā)生降解生成丁二酰亞胺。mPEG－SBA和rhEPO反應(yīng)溶液在丁二酰亞胺位置處有較強(qiáng)吸收峰（見圖3），說(shuō)明mPEG－SBA和rhEPO反應(yīng)后，釋放出丁二酰亞胺。PEG－EPO供試品溶液在丁二酰亞胺位置處無(wú)吸收峰（圖4），說(shuō)明經(jīng)過(guò)純化工藝的處理，已經(jīng)去除丁二酰亞胺殘留。

圖1 丁二酰亞胺對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 mPEG－SBA對(duì)照品溶液色譜圖

圖3 mPEG－SBA和rhEPO反應(yīng)溶液色譜圖

圖4 PEG－EPO供試品溶液色譜圖

3.2 線性關(guān)系考察 精密稱取丁二酰亞胺對(duì)照品40 mg，置100 mL容量瓶中，加入注射用水溶解，定容至刻度，再精密吸取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入注射用水定容至刻度，搖勻，各樣品精密吸取10μL，分別注入高效液相色譜儀測(cè)定。將測(cè)得的峰面積響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，以丁二酰亞胺質(zhì)量（μg）作為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為：Y＝8×106X－83 756，r＝1，表明其結(jié)果符合線性相關(guān)，丁二酰亞胺對(duì)照品在0.08～0.8μg范圍與峰面積有良好的線性關(guān)系，見表1。

表1 線性關(guān)系試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.3 精密度試驗(yàn) 以丁二酰亞胺對(duì)照品溶液為供試品，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10μL，六針重復(fù)進(jìn)樣峰面積響應(yīng)值的RSD%為0.61%，小于2%。均符合要求，表明方法的精密度良好，見表2。

表2 精密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)

3.4 回收率試驗(yàn) 按配方量的80%、100%、120%，精密量取已知含量的供試品溶液適量，分別加入不同量的丁二酰亞胺對(duì)照品，按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，平均回收率為100.96%，RSD為0.87%。

3.5 樣品含量的測(cè)定 取3批自制樣品進(jìn)行丁二酰亞胺殘留量的測(cè)定，按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果均為零，未檢測(cè)出丁二酰亞胺殘留。

4 討論

檢測(cè)波長(zhǎng)采用紫外掃描法（200～350 nm），得出丁二酰亞胺在210 nm處有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)確定在210 nm。在摸索實(shí)驗(yàn)中曾經(jīng)采用常規(guī)的C18柱，但丁二酰亞胺屬于極性物質(zhì)，其保留能力很弱甚至根本不能保留，不易與雜質(zhì)分開檢測(cè)。當(dāng)采用極性的C18AQ色譜柱時(shí)，其保留時(shí)間較長(zhǎng)，故確定使用C18AQ色譜柱進(jìn)行分析。最終確定流動(dòng)相為0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）。

本公司自制3批PEG－EPO樣品丁二酰亞胺殘留量檢測(cè)結(jié)果均為零，說(shuō)明mPEG－SBA與rhEPO反應(yīng)后生成的丁二酰亞胺，經(jīng)離子交換層析等純化步驟后可以完全去除，不會(huì)在PEG－EPO蛋白藥物中殘留，確保了患者用藥的安全。

［1］Silva M，Grillot D，Benito A，et al.Erythropoietin can promote erythroid progenitor survival by repressing apoptosis through Bcl－XL and Bcl－2［J］.Blood，1996，88（5）：1576－1582.

［2］鄭法雷，李明喜，單淵東，等.國(guó)產(chǎn)重組人紅細(xì)胞生成素注射液治療腎性貧血的療效觀察［J］.中國(guó)實(shí)用內(nèi)科雜志，1998，18（12）：726－728.

［3］畢文志，婁思權(quán)，譚軍，等.重組人紅細(xì)胞生成素在外科圍手術(shù)期紅細(xì)胞動(dòng)員中的作用［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81（5）：303－305.

［4］蔡林輝，杜宏武.持續(xù)型紅細(xì)胞生成素受體激活劑研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2010，24（1）：73－76.

［5］Farhad Shirini，Nader Ghaffari Khaligh.Succinimide－N－sulfonic acid：An efficient catalyst for the synthesis of xanthene derivatives under solvent－free conditions［J］.Dyes and Pigments，2012，95（3）：789－794.

Determ ination of succinim ide residual in PEG－EPO by HPLC

PANG Jia-pei1，2，PANG Jian-yong1，2，XU Guo-li1，2，XIE Fu-sheng1，2
（1.Shandong E－Hua Biopharmaceutical Co.，Ltd.，Donge 252201，China；2.Shandong Dong－E E－Jiao Co.，Ltd.，Donge 252201，China）

ObjectiveTo establish a method for the determination of residual succinimide in PEG－EPO by HPLC.M ethodsHPLCmethod was used and the separation was performed on a column packed with Shiseido Capcell PAK C18AQ（4.6 mm×250 mm，5μm）.The mobile phase was 0.02 mol·L－1KH2PO4（pH 6.5）.The detective wavelength was set at210 nm.The flow rate was 0.7 mL·min－1.ResultsThe linear range was good in 0.08～0.8μg（r＝1）.The RSD of peak area of six repeated samplingwas0.61%.The average recovery was100.96%.ConclusionThe established method was simple，high sensitive and accuratewith a high reproducibility and can be used for the determination of residual succinimide in PEG－EPO.

Pegylated recombinant human erythropoietin（PEG－EPO）；Succinimide；HPLC

R927.1

A

2095－5375（2014）12－0686－003

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制專項(xiàng)（No.2012ZX09202－031－004）

龐甲佩，男，研究方向：生物制藥，E－mail：pangjiapei＠163.com