劉擎 楊燁 嚴(yán)宏

高糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞硫醇轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響△

劉擎 楊燁 嚴(yán)宏

糖尿病性白內(nèi)障；高糖；晶狀體上皮細(xì)胞；硫醇轉(zhuǎn)移酶

目的觀察高濃度葡萄糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞硫醇轉(zhuǎn)移酶(thioltransferase，TTase)表達(dá)的影響。方法將體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細(xì)胞分別用葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1(正常對(duì)照組)、15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1及35.5 mmol·L-1(不同濃度高糖組)，胎牛血清體積分?jǐn)?shù)均為15%的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)5.5 mmol·L-1葡萄糖+30.0 mmol·L-1甘露醇高滲對(duì)照組，24 h后Western-blotting檢測(cè)TTase表達(dá)情況。選擇35.5 mmol·L-1高糖濃度培養(yǎng)細(xì)胞，分別在0 h、2 h、8 h、16 h、24 h時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，Western-blotting檢測(cè)TTase表達(dá)，并測(cè)定TTase活性，細(xì)胞內(nèi)總谷胱甘肽(T-GSH)、還原型谷胱甘肽(GSH)與氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量，計(jì)算GSSG與T-GSH的比值。結(jié)果TTase表達(dá)隨葡萄糖濃度增加逐漸增強(qiáng)，在35.5 mmol·L-1高糖組中表達(dá)最強(qiáng)，約為正常對(duì)照組的2.3倍(P<0.01)，25.5 mmol·L-1高糖組約為正常對(duì)照組1.7倍(P<0.05)，甘露醇高滲對(duì)照組TTase表達(dá)與正常對(duì)照組相比無(wú)明顯變化(P>0.05)。在35.5 mmol·L-1高糖處理后2 h，TTase表達(dá)開始增高，8 h表達(dá)達(dá)到高峰，約為正常對(duì)照組的2.0倍(P<0.01)，隨后逐漸下降，16 h時(shí)約為正常對(duì)照組1.7倍(P<0.01);24 h降為1.5倍(P<0.05)。與TTase表達(dá)類似，TTase活性在35.5 mmol·L-1高糖處理后2 h開始升高，8 h達(dá)到高峰，約為正常對(duì)照組的1.8倍(P<0.01)，隨后逐漸下降。GSH在35.5 mmol·L-1高糖處理后16 h較對(duì)照組明顯下降(P<0.05)。GSSG和GSSG/T-GSH比值在35.5 mmol·L-1高糖處理2 h后均顯著升高，分別約為正常對(duì)照組的3.5倍(P<0.001)和3.3倍(P<0.001)，并隨時(shí)間推移不斷上升。結(jié)論高糖可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)上調(diào)、活性增強(qiáng)，同時(shí)伴GSH的含量下降，GSSG含量上升。

[眼科新進(jìn)展，2014，34(3)：201-204]

硫醇轉(zhuǎn)移酶(thioltransferase，TTase)又稱谷氧還蛋白(glutaredoxin，GRx)，是一種廣泛存在于動(dòng)物各個(gè)組織細(xì)胞中的二硫化物還原酶，其主要作用是還原蛋白質(zhì)與谷胱甘肽(glutathion,GSH)形成的二硫化物(PSSG)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)巰基與二硫化物的比例，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡。

糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病患者常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，目前有三種學(xué)說(shuō)來(lái)解釋，即滲透壓學(xué)說(shuō)、蛋白質(zhì)糖基化學(xué)說(shuō)和氧化應(yīng)激學(xué)說(shuō)[1-4]，而氧化應(yīng)激作為三個(gè)學(xué)說(shuō)的中心環(huán)節(jié)倍受關(guān)注。作為體內(nèi)重要的抗氧化修復(fù)酶，TTase在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制中的作用如何？本實(shí)驗(yàn)初步觀察了高糖引起的人晶狀體上皮細(xì)胞氧化損傷過(guò)程中TTase的表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究糖尿病性白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料人晶狀體上皮細(xì)胞(human lens epithelial cells B3,HLEC B3；第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院眼科保存)胎牛血清；DMEM培養(yǎng)基，2.5 g·L-1胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；D-葡萄糖，GSH，β-NADPH，HEDS，谷胱甘肽還原酶(美國(guó)Sigma公司)；兔抗人TTase多克隆抗體，兔抗人β-actin多克隆抗體，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)；GSH和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione,GSSG)檢測(cè)試劑盒，RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(安美生物技術(shù)有限公司)。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及高濃度葡萄糖的處理HLEC B3在含5.5 mmol·L-1葡萄糖，體積分?jǐn)?shù)為15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2孵箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板中。正常對(duì)照組培養(yǎng)液葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1，高糖組培養(yǎng)液葡萄糖濃度分別設(shè)為15.5 mmol·L-1、25.5 mmol·L-1及35.5 mmol·L-1，同時(shí)設(shè)5.5 mmol·L-1葡萄糖+30.0 mmol·L-1甘露醇作為高滲對(duì)照組，培養(yǎng)液胎牛血清體積分?jǐn)?shù)均為15%，6孔板低糖培養(yǎng)24 h后換不同濃度高糖及高滲培養(yǎng)液，24 h后收集細(xì)胞待測(cè)。

1.2.2Westernblotting檢測(cè)TTase蛋白表達(dá)量對(duì)正常培養(yǎng)細(xì)胞換用35.5 mmol·L-1高糖培養(yǎng)液，分別于0 h、2 h、8 h、16 h、24 h收集細(xì)胞待測(cè)。將細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)密度每孔加入適量RIPA裂解液及PMSF，低溫條件下裂解30 min后將細(xì)胞刮于一側(cè)，用移液器將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min，BCA法測(cè)定上清液中總蛋白濃度，加上樣緩沖液煮沸，按每孔100 μg上樣，進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h后根據(jù)不同目的條帶加入抗TTase或抗β-actin抗體于4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h，ECL發(fā)光、顯影。用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，TTase表達(dá)的變化以各組中相應(yīng)條帶的灰度值相對(duì)于β-actin的倍數(shù)表示。

1.2.3TTase活性測(cè)定GSSG在谷胱甘肽還原酶的催化下，由NADPH供氫，還原成GSH，NADPH因消耗而減少。采用Sigma公司的GSH、β-NADPH、HEDS、谷胱甘肽還原酶等生化試劑，通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)30 ℃條件下，1 min內(nèi)NADPH在340 nm波長(zhǎng)處吸光度值的降低情況，可用來(lái)表示TTase的活性，具體操作按照Raghavachari等[5]采用的方法。

1.2.4細(xì)胞GSH和GSSG含量測(cè)定將細(xì)胞用PBS洗滌1次，加適量PBS后將細(xì)胞刮下，離心后吸盡上清。加入細(xì)胞沉淀體積3.0倍量的蛋白去除試劑M溶液，充分混勻，然后利用液氮和37 ℃水浴對(duì)樣品進(jìn)行兩次快速的凍融，離心取上清，按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定總GSH及GSSG，還原型GSH=總GSH-2×GSSG。

1.2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間總體比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1不同濃度葡萄糖干預(yù)對(duì)HLECTTase表達(dá)的影響經(jīng)過(guò)24 h不同濃度的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)后收集細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)TTase表達(dá)隨葡萄糖濃度增加逐漸增強(qiáng)，在35.5 mmol·L-1高糖組中最強(qiáng)，TTase表達(dá)量約為正常對(duì)照組的2.3倍(P<0.01)；25.5 mmol·L-1高糖組次之，TTase表達(dá)量約為正常對(duì)照組1.7倍(P<0.05)；15.5 mmol·L-1高糖組及高滲對(duì)照組與正常對(duì)照組相比TTase表達(dá)無(wú)明顯變化(均為P>0.05，見(jiàn)圖1)。

2.2高糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)HLECTTase蛋白表達(dá)和活性的影響正常低糖培養(yǎng)的細(xì)胞換35.5 mmol·L-1高糖培養(yǎng)2 h后TTase表達(dá)開始升高，8 h達(dá)到高峰，約為正常對(duì)照組的2.0倍(P<0.01)；隨后逐漸下降，16 h時(shí)約為正常對(duì)照組的1.7倍(P<0.01)；經(jīng)過(guò)24 h干預(yù)，TTase表達(dá)降為正常對(duì)照組1.5倍(P<0.05，見(jiàn)圖2A)。TTase活性在高糖培養(yǎng)2 h后開始升高；8 h達(dá)到高峰，約為正常對(duì)照組的1.8倍(P<0.01)；隨后逐漸下降，16 h時(shí)約為正常對(duì)照組的1.6倍(P<0.01)；24 h時(shí)降為正常對(duì)照組的1.5倍(P<0.01，見(jiàn)圖2B)。

2.3高糖干預(yù)不同時(shí)間對(duì)HLECB3GSH與GSSG含量的影響正常低糖培養(yǎng)的細(xì)胞換35.5 mmol·L-1高糖培養(yǎng)，細(xì)胞GSH含量在高糖加入后隨時(shí)間推移逐漸下降，從16 h后開始與正常對(duì)照組相比顯著降低，約為正常對(duì)照組含量的71%(P<0.05)；24 h時(shí)約為正常對(duì)照組的67%(P<0.05，見(jiàn)圖3A)。GSSG含量及GSSG/T-GSH在高糖干預(yù)2 h時(shí)分別約為對(duì)照組的3.5倍(P<0.001)和3.3倍(P<0.001)，隨后一直處于較高水平，且呈逐漸上升趨勢(shì)(圖3B，見(jiàn)圖3C)。

3 討論

1974年Askel?f等[6]首次在大鼠肝組織中發(fā)現(xiàn)TTase，隨后Holmgren等[7]在大腸桿菌中也發(fā)現(xiàn)TTase的存在。在哺乳動(dòng)物中，TTase有兩種同工酶，存在于細(xì)胞質(zhì)的TTase-1和近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的存在于線粒體中的TTase-2[8-9]。許多研究證明了TTase-1對(duì)維持細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的重要作用，而關(guān)于TTase-2的研究較少，其作用仍不清楚。1996年Raghavachari等[5]首次報(bào)道牛眼晶狀體中存在TTase。隨后在對(duì)人、雞胚和大鼠等不同物種的比較研究中發(fā)現(xiàn)，不同物種晶狀體中TTase的活性類似，且TTase在晶狀體皮質(zhì)和晶狀體核中分布比較均勻，而晶狀體上皮細(xì)胞中的TTase含量是皮質(zhì)和核的3～4倍。晶狀體上皮細(xì)胞位于晶狀體前囊膜下，是晶狀體的生發(fā)中心，也是抵抗外界刺激的中心和代謝最活躍的部位，對(duì)晶狀體的生長(zhǎng)發(fā)育、維持透明性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性具有十分重要的作用。由于晶狀體長(zhǎng)期處于各種內(nèi)源性或外源性氧化因子的作用下，晶狀體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)對(duì)于防止白內(nèi)障的發(fā)生起著關(guān)鍵的作用[10]。晶狀體內(nèi)高水平的GSH是抗氧化損傷重要的第一道防線，對(duì)抵抗活性氧和維持蛋白質(zhì)的還原狀態(tài)非常重要，第二道防線則是各種修復(fù)酶，TTase就是其中之一[11]。TTase在抵抗氧化應(yīng)激，調(diào)節(jié)晶狀體的氧化還原狀態(tài)方面發(fā)揮著非常重要的作用。L?fgren等[12]研究發(fā)現(xiàn)TTase基因敲除鼠晶狀體上皮細(xì)胞GSH水平降低，谷胱甘肽化蛋白質(zhì)大量增加，細(xì)胞對(duì)H2O2的清除能力降低，而將重組人晶狀體TTase導(dǎo)入細(xì)胞后，細(xì)胞抗氧化能力接近正常。糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制尚未明確，但氧化應(yīng)激參與了其發(fā)病已得到了廣泛的證實(shí)[13-14]。研究顯示，糖尿病性白內(nèi)障大鼠或2型糖尿病性白內(nèi)障患者的晶狀體或房水抗氧化水平如GSH、SOD和CAT含量明顯低于對(duì)照組，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物高于對(duì)照組[15]。作為體內(nèi)重要的抗氧化修復(fù)酶，TTase是否參與了高糖誘導(dǎo)的氧化損傷的修復(fù)、發(fā)揮保護(hù)性作用尚未有研究報(bào)道。

本研究首先采用不同濃度葡萄糖干預(yù)離體培養(yǎng)的HLEC，發(fā)現(xiàn)TTase表達(dá)與葡萄糖濃度存在相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)，葡萄糖濃度越高，TTase表達(dá)量越多。隨后又觀察了TTase的表達(dá)及其活性隨高糖刺激時(shí)間變化的情況，在高糖干預(yù)早期TTase表達(dá)和活性迅速上調(diào)，而隨著高糖持續(xù)時(shí)間增加逐漸下降。高糖引起細(xì)胞內(nèi)重要的抗氧化物GSH含量降低，而GSSG與T-GSH的比值顯著增加，隨著高糖持續(xù)時(shí)間增加逐漸上升。Raghavachari等[5]報(bào)道了HLEC在給予0.1 mmol·L-1H2O2刺激后，TTase在10 min時(shí)表達(dá)增加了近2倍，60 min時(shí)恢復(fù)到基線水平，TTase活性變化與其表達(dá)情況類似，活性在10 min時(shí)達(dá)到高峰，60 min時(shí)恢復(fù)至基線水平。Bhuyan等[16]對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)白內(nèi)障小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，3周后與TTase類似的另一種抗氧化修復(fù)酶硫氧還蛋白表達(dá)上調(diào)了5倍，然后逐漸下降。這些變化可能是機(jī)體對(duì)早期氧化應(yīng)激的一種反應(yīng)性保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中，TTase的表達(dá)與活性隨高糖刺激時(shí)間變化趨勢(shì)與這些報(bào)道類似，我們推測(cè)高糖干預(yù)晶狀體上皮細(xì)胞早期TTase表達(dá)迅速上調(diào)，活性增強(qiáng)，可能是細(xì)胞對(duì)抗高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激的一種自我保護(hù)機(jī)制，而隨著應(yīng)激持續(xù)時(shí)間增加，GSH等抗氧化物質(zhì)的不斷消耗，當(dāng)TTase的表達(dá)上調(diào)不足以抵抗氧化損傷時(shí)，其表達(dá)與活性逐漸下降，細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡狀態(tài)被打破，若高糖刺激持續(xù)存在，細(xì)胞內(nèi)大量蛋白相互交聯(lián)形成二硫化物，這些二硫化物的聚集，最終導(dǎo)致晶狀體由透明變?yōu)榛鞚?，形成白?nèi)障。

綜上所述，高糖可誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞TTase表達(dá)上調(diào)，活性增強(qiáng)，同時(shí)伴GSH的含量下降，GSSG含量上升。TTase可能在糖尿病性白內(nèi)障形成中發(fā)揮保護(hù)性作用，但其作用及調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。

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date：Nov 26，2013

National Natural Science Foundation of China(No：81070720)From theDepartmentofOphthalmology，TangduHospital，theFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710038，ShaanxiProvince，China

Effects of high glucose on thioltransferase expression in human lens epithelial cells

LIU Qing，YANG Ye，YAN Hong

diabetic cataract；high glucose；lens epithelial cells；thioltransferase

ObjectiveTo observe the effects of high glucose on thioltransferase(TTase) expression in human lens epithelial cells.MethodsHuman lens epithelial cells B3(HLEC B3) were cultured in DMEM containing 15% fetal bovine serum and exposed to 5.5 mmol·L-1glucose(control group)，15.5 mmol·L-1，25.5 mmol·L-1，35.5 mmol·L-1high glucose groups and mannitol control group.After 24 hours，incubation cells were gathered and TTase expression was examined by Western blotting.Cells were then gathered at 0，2 hours，8 hours，16 hours and 24 hours after incubation with 35.5 mmol·L-1high glucose，respectively.TTase expression and its activity were examined and the levels of T-GSH，GSH and GSSG of HLEC B3 were measured.GSSG/T-GSH ratio was calculated.ResultsWith the raise of the concentration of high glucose，the expression of TTase increased gradually and the maximum expression appeared in 35.5 mmol·L-1group，almost 2.3 times to the control group(P<0.01).No changes was observed in the mannitol control group(P>0.05).The expression of TTase increased after treated with high glucose of 35.5 mmol·L-1for 2 hours and reached the top for 8 hours，nearly 2.0 times to control group(P<0.01) and then decreased gradually.Similarly，TTase activity in 35.5 mmol·L-1group increased from 2 hours，reached at 8 hours，nearly 1.8 times to control group(P<0.01)，then decreased gradually.The level of GSH decreased after treated with 35.5 mmol·L-1glucose and was significantly lower at 16 hours than control group(P<0.05).The level of GSSG and the ratio of GSSG/T-GSH increased significantly after 2 hours incubation with 35.5 mmol·L-1glucose，nearly 3.5 times(P<0.001) and 3.3 times(P<0.001) to the control group，respectively，and continued to elevate with time.ConclusionThe expression and activity of TTase in HLE cells increase after treatment with high glucose，in which the GSH level decrease and GSSG level increase.

劉擎，男，1987年5月出生，在讀碩士研究生。聯(lián)系電話：029-84777445；E-mail：chinaliuqing@163.com

AboutLIUQing：Male，born in May，1987.Postgraduate student.Tel：+86-29-84777445；E-mail：chinaliuqing@163.com

2013-11-26

國(guó)家自然科學(xué)基金資助(編號(hào)：81070720)

710038 陜西省西安市，第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院眼科

嚴(yán)宏，E-mail：yhongb@fmmu.edu.cn

劉擎,楊燁,嚴(yán)宏.高糖對(duì)人晶狀體上皮細(xì)胞硫醇轉(zhuǎn)移酶表達(dá)的影響[J].眼科新進(jìn)展,2014,34(3):201-204.

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10.13389/j.cnki.rao.2014.0053

修回日期：2013-12-16

本文編輯：董建軍

Accepteddate：Dec 16，2013

Responsibleauthor：YAN Hong，E-mail：yhongb@fmmu.edu.cn

[RecAdvOphthalmol，2014，34(3)：201-204]