從青霉素的發(fā)現(xiàn)與應用談研究生科研提問能力的培養(yǎng)

刁宗平，章建全

(第二軍醫(yī)大學 附屬長征醫(yī)院超聲醫(yī)學教研室，上海 200003 )

從青霉素的發(fā)現(xiàn)與應用談研究生科研提問能力的培養(yǎng)

刁宗平，章建全

(第二軍醫(yī)大學 附屬長征醫(yī)院超聲醫(yī)學教研室，上海 200003 )

研究生在獲得專業(yè)知識的同時，還需要結合文獻閱讀提出新的科研問題，并設計實驗方案來解決提出的問題。本文作者以青霉素的發(fā)現(xiàn)、制備、應用為案例進行教學，淺析如何提出問題以及提出問題所用的思維方式，以啟發(fā)研究生運用求異和置換的思維方式來提出新穎的科研問題，并設計實驗來回答提出的問題，從而為研究生完成學術論文奠定良好的基礎。

青霉素；案例教學；求異思維；置換思維

中國有句古話：“讀萬卷書，行千里路”，然而多數(shù)學生即便讀了萬卷書，卻沒能行上千里路！換句話說他們不缺知識，缺的是創(chuàng)造新知識、新方法的能力。綜合分析，這種死讀書、少創(chuàng)造的重要原因之一可能是我國的教育模式?jīng)]有能夠幫助學生塑造起創(chuàng)新的思維。多少年來，應試教育強調(diào)的是統(tǒng)一，灌輸?shù)氖侵R，贊揚的是分數(shù)，而忽略的是個性化的創(chuàng)新思維，湮沒的是獨立思考的意識，由此以來教師的問題便是學生的問題，教師不提問題學生自己便提不出問題。如何在現(xiàn)有的教育大氛圍中讓不會提問題的研究生，改變過去的思考方式，提出一個新穎的科研問題，就成為研究生完成學術論文、進行科研選題的關鍵。本文以青霉素為案例教學，談談其發(fā)現(xiàn)過程；在其發(fā)現(xiàn)及應用過程中是如何提出問題；以及提出新問題所用的思維方式；并就如何提出問題給出了一些建議。

1 青霉素的發(fā)現(xiàn)及應用過程

青霉素(penicillin, PCN)是一種能破壞細菌細胞壁，在繁殖期起殺菌作用的抗生素，可在青霉菌培養(yǎng)液中提取。合成后的青霉素可以對抗更多類型的細菌，擴大了抗菌譜，改善了耐藥問題。Alexander Fleming、Howard Walter Florey和Ernest Boris Chain因?qū)λ难芯?，?945年共同獲得了諾貝爾醫(yī)學獎和生理學獎。

首先是1928年，Alexander Fleming[1]發(fā)現(xiàn)一種霉菌可生產(chǎn)某種對葡萄球菌有害的物質(zhì)，后證明了這種物質(zhì)能抑制許多其它有害細菌的生長，將其命名為青霉素。但是，青霉素可以用于人體以滅菌嗎？怎樣能獲得大量的青霉素？Fleming不清楚。這個問題成為Howard Walter Florey和Ernest Boris Chain的研究方向。終于在1942年，他們在美國找到了大量生產(chǎn)、分離、純化出青霉素的方法，同時還發(fā)現(xiàn)了青霉素可以用于小白鼠以抗菌，隨后廣泛用于人類[2]。那么青霉素菌滅菌的作用機制是什么？

1950年，Park及其同事在進一步的研究中，則觀察到受抑制的葡萄球菌累積了尿核苷，推測這是由于青霉素阻斷了細菌細胞壁合成的某一步。1957年，人們闡明了粘肽的結構及其生物合成，并確定了青霉素是阻斷了粘肽生物合成的最后一步(轉(zhuǎn)肽反應)，1972年，Sujinaka首先報道了細菌的細胞膜上有特殊的蛋白質(zhì)分子，被稱之為青霉素結合蛋白(Penicillin Bonding Proteins，PBPs)，當時發(fā)現(xiàn)它能和青霉素共價結合而得名，后來研究發(fā)現(xiàn)PBPs也能與非β2內(nèi)酰胺類抗生素結合[3]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，它為4萬-12萬的膜蛋白，具有很高的轉(zhuǎn)肽酶和羥肽酶活力，是在細菌生長過程中起重要作用的蛋白質(zhì)，同時也是青霉素類抗生素抑制作用的靶蛋白。青霉素作為PBPs底物的結構類似物，競爭性地與酶活性位點共價結合，從而抑制PBPs，干擾細菌細胞壁的合成，以達到殺滅細菌的作用。主要機制是：青霉素含有高活性β-內(nèi)酰胺環(huán)，與連接MNAC的五肽的最后二肽(即D-丙氨酰-D-丙氨酸)結構相似，轉(zhuǎn)肽酶與β-內(nèi)酰胺環(huán)的酰胺鍵共價結合，形成乙?；D(zhuǎn)化酶，使轉(zhuǎn)肽作用不能進行，交叉聯(lián)結受阻，致細胞壁缺損，而失去保護屏障。由于菌體內(nèi)滲透壓高，在等滲環(huán)境中水分不斷滲入，致細胞腫脹、變形，在自溶酶激活影響下，細菌破裂溶解而死亡。至此，青霉素滅菌的作用機制已經(jīng)研究清楚。

然而，隨著青霉素類抗生素的廣泛應用，細菌耐藥性的問題逐漸顯現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)PBPs介導的細菌對青霉素類抗生素的耐藥性與其基因結構發(fā)生改變有重要關系。那么青霉素結合蛋白的基因序列如何？它對細菌耐藥性有無影響？最早Spratt和Pardee用聚丙烯酰胺凝膠電泳法( polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE )分離出PBPs的編碼基因，并按分子量大小分為高分子量A類、高分子量B類和低分子量三種類型?，F(xiàn)在人們用分子動力學模擬，量子力學及X-射線衍射等方法進一步研究了PBPs的晶體結構，活性位點的氨基酸序列及抗生素與PBPs具體?；襟E。目前已搞清楚金黃色葡萄球菌的PBP2a晶體結構是由三部分組成：①N-末端跨膜區(qū)；②糖基轉(zhuǎn)移酶區(qū)；③轉(zhuǎn)肽酶區(qū)，含β-內(nèi)酰胺類抗生素作用位點[4]。如果這些保守序列或相鄰的氨基酸被替代，β-內(nèi)酰胺類抗生素不能有效地與PBPs結合而導致耐藥。從此，青霉素結合蛋白成為細菌耐藥性研究的熱點，明確了PBPs的數(shù)量和種類或者與抗生素的親和力發(fā)生變化，都會影響細菌的形態(tài)和對抗生素的敏感性．從而產(chǎn)生耐藥性。

2 青霉素的發(fā)現(xiàn)及應用過程中提出的問題

從PCN的發(fā)現(xiàn)及應用過程可以看出，每一個研究都引出了一個新的問題。即：在發(fā)現(xiàn)青霉素可以抑制金黃色葡萄球菌生長以后，引出的問題是：它可以在動物上發(fā)揮作用嗎？怎樣才能大量生產(chǎn)？從發(fā)現(xiàn)可用以人類抗菌及可以大量提純、生產(chǎn)以后，引出的問題是：青霉素抗菌的作用機制如何？在發(fā)現(xiàn)了青霉素可以阻礙細菌細胞壁合成以后，引出的問題是：它如何阻礙細胞壁的合成？研究發(fā)現(xiàn)某些細菌細胞壁上存在青霉素結合蛋白(PBPs)，它可以通過轉(zhuǎn)肽作用合成細胞壁，作為靶器官，青霉素與之結合，導致細胞壁不能正常合成而缺失。隨著抗生素的廣泛應用，細菌的耐藥性問題逐漸增多，引出的問題是：PBPs的基因序列如何？它對細菌耐藥性有無影響？研究得出，它的基因序列結構的變化可以導致細菌耐藥性。而后引出的問題是：怎樣能從基因水平上來控制細菌耐藥性的問題，這些研究最終導致青霉素結合蛋白成為生物學研究的熱點。

3 青霉素發(fā)現(xiàn)及應用過程中提出問題所運用的思維方式

PCN的研究過程采用了哪些思維方式呢？最突出的是在前人研究的基礎上，運用求異的思維方式，問一個不同的問題。問題的與眾不同，就會導致與眾不同的實驗。其次是運用置換的思維方式，將研究內(nèi)容置換一下。例如當發(fā)現(xiàn)青霉素能夠抗菌后，將研究殺滅細菌的現(xiàn)象置換成滅菌的作用機制；當發(fā)現(xiàn)滅菌主要是干擾細菌細胞壁合成以后，又對細胞壁的合成機理進行研究；當發(fā)現(xiàn)細胞膜上與青霉素結合的靶蛋白是PBPs，又對PBPs的基因序列進行研究；研究發(fā)現(xiàn)PBPs的基因序列的改變與細菌耐藥性有關?？偠灾螽愃季S和置換思維可以說是滲透著青霉素研究及應用的全部過程。這也說明求異和置換這兩種思維方式是科研人員的基本思維方式。

4 如何根據(jù)文獻提出新穎的問題

由青霉素發(fā)現(xiàn)及應用的思維方式可以看出：在前人的研究基礎上，采用求異思維和置換思維提出一個新穎的科研問題、設計實驗是科學研究的基本要求。無數(shù)科學家的的研究實踐證明：探究源于疑問，科研發(fā)仞于選題。如何在研究生的學習、科研過程中，給他們一些建議，促使他們能夠在前人研究的基礎上選擇一個新穎的問題呢？

在教學過程中，運用這個成功的科研例子，把青霉素的研究及應用過程中科學家們?nèi)绾翁岢鰡栴}，且把他們所采用的思維方式講述出來，可以讓研究生明白：科學研究首先采用求異的思維方式，提出新問題；只要具有了新穎的題目，就可另辟蹊徑，獨樹一幟，避免重復研究。然后，采用置換的思維方法設計實驗，解決這個問題。例如置換實驗環(huán)境，觀察這種現(xiàn)象是否在其他溫度下也如此？置換部分基因序列，觀察結果如何？只要抓住問題關鍵，深入思考，就能不斷提出各種問題，異于前人，先于他人。最后，腳踏實地，循序漸進，解決問題。

在指導研究生選題時，運用將科研成果的研究過程和思維方式相結合的教學方式，效果令人滿意。例如，趙璐璐等[5]在閱讀有關甲狀腺結節(jié)消融的文獻時，發(fā)現(xiàn)頜下腺占位的消融鮮有人報道，于是嘗試將頜下腺和甲狀腺結節(jié)共同消融的治療方式，取得了滿意的療效，并將成果發(fā)表在第二軍醫(yī)大學學報上。劉燦等[6]同樣在閱讀甲狀腺結節(jié)消融的文獻時，發(fā)現(xiàn)甲狀腺結節(jié)消融報道的較多，他將消融目標置換為甲狀旁腺腺瘤，消融后隨訪患者預后，反映良好，并將相關研究結果發(fā)表在第二軍醫(yī)大學學報上。另外，筆者等[7]在研究生期間，由導師指導，閱讀有關利用彈性超聲評價人體各器官質(zhì)地軟硬程度的文獻時，將評價目標置換為離體的正常豬肝及消融后的豬肝，發(fā)現(xiàn)了許多新鮮的問題，獲取了第一手數(shù)據(jù)資料，并將研究結果發(fā)表在中華超聲影像學雜志上。

總之，采用這種教學方法可以指導研究生在閱讀文獻時，提出新穎的科研問題，并設計實驗來回答問題，從而使他們順利地完成學位論文，走進科研的大門。

[1]Fleming A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillin，with Special Reference to Their Use in the Siolation of B Influenza [J]．Br J Exp Pathol，1926, 10(3)：226．

[2]Florey H W．Antibiotics [M]．London Oxford University press, 1949：230．

[3]Deka R K, Machius M, et al. Crystal structure of the 472-kDa lipoprotein of Treponema pallidum reveals a novel penicillin 2 binding protein [J].BiolChem, 2002, 277(44): 41857-41864.

[4]Tomasz A．“Intelligence coup” for drug designers：crystal structure of Staphylococcus aureus beta-lactam resistance protein PBP2A [J]. Lancet，2003，361(9360)：795.

[5]趙璐璐，章建全. 甲狀腺與下頜下腺結節(jié)同期微波消融治療的初步嘗試 [J]．第二軍醫(yī)大學學報，2013，34(9)：96-98．

[6]劉 燦，章建全. 超聲引導下經(jīng)皮射頻消融治療甲狀旁腺腺瘤的初步臨床應用 [J]．第二軍醫(yī)大學學報，2013，34(4)：371-374．

[7]章建全，刁宗平. 離體豬肝微波消融灶的彈性變化及其病理意義[J]. 中華超聲影像學雜志，2011，20(1)：76-79．

(責任編輯：陳新東)

2014-07-08

刁宗平(1984-)，女，碩士，專業(yè)方向：超聲診斷與介入治療。

章建全

G644

：A

：1006-2769(2014)06-1048-03