鹽度變化對攜帶白斑綜合癥病毒(WSSV)的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)的影響*

向 赟 王 剛 葉國鋒 陳兆明 楊世平, 王成桂 孫成波,①

(1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 湛江 524025;2.廣東高校熱帶海產(chǎn)無脊椎動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心 湛江 524025)

白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus,WSSV)是一種對蝦高致死性病毒,其宿主廣泛,傳染性強,感染后出現(xiàn)癥狀 6—7d死亡率可達 80%—100%,造成的危害極大(Momoyanaet al,1994)。已使世界 30多個國家對蝦養(yǎng)殖業(yè)蒙受巨大損失,部分地區(qū)對蝦養(yǎng)殖業(yè)瀕臨絕境,嚴(yán)重制約了全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Tapayet al,1999;Flegelet al,2009),而在我國1993年開始大規(guī)模暴發(fā)流行。近年很多研究發(fā)現(xiàn)引起白斑綜合癥暴發(fā)的原因不僅與蝦體的免疫水平、病毒數(shù)量、感染方式有關(guān),還與環(huán)境因子密切相關(guān),例如溫度、鹽度、pH、氨氮含量等(吳信忠,2005;孫成波等,2006)。如高溫或者低溫可以抑制WSSV在對蝦體內(nèi)增殖(Jiravanichpaisalet al,2004;Duet al,2006;Granjaet al,2006)。pH升高可能提高斑節(jié)對蝦死亡率(Gunalanet al,2010)。鹽度在1h內(nèi)突變大于4,會引起中國對蝦體內(nèi)WSSV迅速增殖和抗病能力降低(Liuet al,2006)。環(huán)境中鹽度只有在對蝦體液的等滲點附近,對蝦才能保證正常的生理和生長狀況。徐麗美等(2001)通過定量 PCR方法初步將每毫克組織含 103個病毒粒子作為疾病暴發(fā)的危險臨界值;何建國等(1999)認(rèn)為WSSV的潛伏期感染具有很大的危害性,且潛伏期感染轉(zhuǎn)為急性感染受眾多氣候和水環(huán)境因子影響。凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是我國乃至全世界最主要的對蝦養(yǎng)殖品種,本文研究不同鹽度變化對感染 WSSV的凡納濱對蝦的影響,對其產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 健康對蝦來源 健康凡納濱對蝦取自廣東海洋大學(xué)東海島海洋生物研究基地,體長為(7.71±0.98)cm。實驗前隨機抽取 10尾對蝦進行熒光定量PCR檢測,檢測結(jié)果為陰性。實驗前暫養(yǎng)5d,投喂對蝦人工配合餌料 2次/d,換水 1次/d,日換水量接近100%。

1.1.2 WSSV粗提液制備 取感染W(wǎng)SSV癥狀明顯的凡納濱對蝦,去除甲殼,按 1︰1(W︰V)加入高鹽PBS,冰浴中勻漿,將勻漿液于4°C、7000r/min離心15min;離心后的上清液加入蔗糖至終濃度為30%(W/W),4°C、16000r/min超速離心 50min,棄上清,沉淀用PBS(pH 7.4)重懸,將重懸液用0.45μm的濾膜過濾,分裝后?80°C冰箱保存。

1.1.3 DNA模板提取和引物設(shè)計 DNA模板提取方法參照Sun等(2013)的方法,PCR引物參照You等(2010)的引物設(shè)計,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.4 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 參照程曉燕等(2010)的方法制備重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用核酸分析儀測定重組質(zhì)粒的 DNA濃度,根據(jù)拷貝數(shù)公式計算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。

式中,阿伏加德羅常數(shù)為 6.02×1023,重組質(zhì)粒分子量 = 1個堿基對的平均分子量(660g/mol)×重組質(zhì)粒的總長度(bp)。

1.2 實驗方法

1.2.1 感染方式 本實驗采用人工注射感染,在凡納濱對蝦第2腹節(jié)與第3腹肌之間往心臟方向注射40μL用PBS緩沖液稀釋104倍的病毒粗提液。

1.2.2 鹽度變化實驗 鹽度變化為起始鹽度(23±1)往高鹽度(32±1)和低鹽度(14±1)進行突變和漸變,突變時間為6h,漸變時間為72h;病毒感染分為變化前和變化后感染兩種方式,實驗組和對照組均設(shè)置 3個平行組,每組對蝦各30尾;實驗組注射40μL PBS緩沖液稀釋 104倍的病毒粗提液,對照組注射 40μL PBS緩沖液。實驗中投喂對蝦人工配合餌料2次/日,24h充氣,定時吸出排泄物,日換水量 50%。及時取出死亡對蝦放入–20°C冰箱保存。各組在感染后0h、6h、12h、24h、48h、72h、96h取樣保存。觀察記錄對蝦發(fā)病及死亡率,定期檢測對蝦組織中病毒含量,并對死亡對蝦進行病毒檢測。

1.2.3 病毒檢測方法 參考程曉燕等(2010)采用熒光定量PCR方法檢測WSSV。

2 結(jié)果

2.1 鹽度突變

2.1.1 鹽度先突變后感染W(wǎng)SSV的結(jié)果

(1)鹽度先突變后感染 WSSV對凡納濱對蝦死亡情況的影響

鹽度先突變后感染 WSSV對凡納濱對蝦死亡情況的影響見圖1,同一鹽度感染W(wǎng)SSV組對蝦累計死亡率顯著高于未感染 WSSV組,且感染W(wǎng)SSV后不同鹽度組的對蝦累積死亡率顯著提高,24h出現(xiàn)死亡高峰,此時低鹽度14±1突變組的累計死亡率(54.1±3.8)%明顯高于高鹽度32±1突變組的(36.7±5.8)%和起始鹽度 23±1組的(24.4±5.1)%。在整個實驗過程中起始鹽度 23±1組累積死亡率顯著低于另外兩突變組(P<0.05),各組累計死亡率至 96h達到最大,起始鹽度23±1為(52.2±13.5)%,高鹽度32±1突變組為(75.6±3.8)%,低鹽度 14±1突變組為(63.3±3.3)%。

圖1 鹽度突變對凡納濱對蝦累積死亡率的影響Fig.1 Effects of salinity acute changes on the mortality of L.vannamei

(2)鹽度突變后感染 WSSV對凡納濱對蝦攜帶WSSV情況的影響

鹽度突變后感染W(wǎng)SSV對凡納濱對蝦攜帶WSSV情況的影響見表1,不同鹽度下病蝦體內(nèi)病毒含量隨感染時間推移逐漸升高。在整個實驗過程中,在6h、24h、48h、96h時高鹽度32±1突變組與起始鹽度23±1組存在顯著差異(P<0.05);在6h、12h、48h、72h時低鹽度14±1突變組與起始鹽度23±1組存在顯著差異(P<0.05)。高鹽度32±1突變組和起始鹽度23±1組對蝦體內(nèi)病毒含量都在96h達到最高值,分別為5.7×107copy/g,2.3×106copy/g,低鹽度突變組在72h達到最高值為2.8×107copy/g。

2.1.2 先感染W(wǎng)SSV后鹽度突變實驗結(jié)果

(1)先感染 WSSV后鹽度突變對凡納濱對蝦死亡情況的影響

先感染 WSSV后鹽度突變對凡納濱對蝦死亡情況的影響見圖2,同一鹽度感染W(wǎng)SSV組對蝦累計死亡率顯著高于未感染 WSSV組,感染 WSSV后鹽度突變導(dǎo)致對蝦累積死亡率顯著提高,在整個實驗過程中高鹽度32±1突變組與起始鹽度23±1組之間不存在顯著差異(P>0.05);低鹽度 14±1突變組與起始鹽度23±1組之間在12h、24h、48h、72h存在顯著差異(P<0.05);各組累計死亡率至96h達到最大,起始鹽度23±1為(48.8±1.9)%,高鹽度32±1突變組為(61.1±10.7)%,低鹽度14±1突變組為(63.3±12.0)%。

表1 鹽度突變后感染W(wǎng)SSV凡納濱對蝦攜帶白斑綜合癥病毒量的情況Tab.1 Effects of salinity acute changes on white spot syndrome virus copy number in L.vannamei infected with WSSV

圖2 先感染W(wǎng)SSV后鹽度突變對凡納濱對蝦累積死亡率的影響Fig.2 Effects of salinity acute changes on the mortality of L.vannamei infected with WSSV

(2)先感染 WSSV后鹽度突變對 WSSV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的影響

表2中不同鹽度下的病蝦體內(nèi)攜帶病毒量隨時間推移而逐漸增多。整個實驗過程中,高鹽度32±1突變組與起始鹽度23±1組在12h、24h、72h、96h存在顯著差異(P<0.05);低鹽度 14±1突變組與起始鹽度 23±1組在 6h、12h、72h、96h存在顯著差異(P<0.05),兩鹽度突變組病毒復(fù)制高峰期出現(xiàn)在鹽度突變后 6h,而起始鹽度23±1組出現(xiàn)在48h。在0h各組病毒含量差異不大,至12h高鹽度32±1突變組病毒含量高出起始鹽度23±1組的30倍,低鹽度14±1突變組高出起始鹽度23±1組的400倍,到48h后各組病毒含量相差不顯著。

表2 感染W(wǎng)SSV后鹽度突變對凡納濱對蝦攜帶白斑綜合癥病毒量的影響Tab.2 Effects of salinity acute changes on white spot syndrome virus copy number in L.vannamei infected with WSSV

2.2 鹽度漸變

2.2.1 先鹽度漸變后感染W(wǎng)SSV實驗結(jié)果

(1)不同鹽度對感染 WSSV凡納濱對蝦死亡情況的影響

不同鹽度對感染W(wǎng)SSV對蝦累積死亡率的影響見圖3,感染W(wǎng)SSV組,在整個實驗過程中,在0—24h各組對蝦累計死亡率差異不顯著(P>0.05),高鹽度 32 ± 1漸變組累計死亡率與起始鹽度23 ± 1組在48h、72h存在顯著差異(P<0.05);低鹽度14 ± 1漸變組與起始鹽度23 ± 1組在48h、72h、96h存在顯著差異(P<0.05)。

圖3 不同鹽度對感染W(wǎng)SSV凡納濱對蝦累計死亡率的影響Fig.3 Effects of different salinity on the mortality of L.vannamei infected with WSSV

(2)鹽度漸變至相應(yīng)鹽度后感染W(wǎng)SSV對WSSV在凡納濱對蝦體內(nèi)增殖的影響

不同鹽度對 WSSV在對蝦體內(nèi)增殖的影響見表3,在整個實驗過程中,0—24h凡納濱對蝦體內(nèi)病毒平均含量較低,在 6h時低鹽度 14 ± 1漸變組與起始鹽度 23 ± 1組存在極顯著性差異(P<0.01),至 12h時高鹽度32 ± 1漸變組與起始鹽度23 ± 1組存在極顯著差異(P<0.01);至 48h出現(xiàn)病毒增殖高峰期,并伴隨死亡高峰期,且高鹽度 32 ± 1漸變組與起始鹽度23 ± 1組存在顯著差異(P<0.05);到 72—96h時凡納濱對蝦體內(nèi) WSSV平均含量趨于平穩(wěn),并伴隨著對蝦死亡。

表3 不同鹽度對感染W(wǎng)SSV凡納濱對蝦體內(nèi)病毒含量的影響Tab.3 Effects of different salinity on white spot syndrome virus copy number in L.vannamei infected with WSSV

2.2.2 先感染W(wǎng)SSV后鹽度漸變實驗結(jié)果

(1)鹽度漸變對攜帶 WSSV的凡納濱對蝦死亡情況的影響

先感染 WSSV后鹽度漸變對對蝦累積死亡率的影響見圖4,在整個實驗過程中,感染W(wǎng)SSV組中高鹽度32±1漸變組與起始鹽度23±1組在6h、12h、24h存在顯著差異(P<0.05);低鹽度 14±1漸變組與起始鹽度 23±1組在整個實驗過程中都存在顯著差異(P<0.05);在鹽度漸變過程中,漸變組伴隨死亡率升高,至24 h后死亡明顯加快,并出現(xiàn)死亡高峰期。

圖4 先感染W(wǎng)SSV后鹽度漸變對凡納濱對蝦累積死亡率的影響Fig.4 Effects of salinity gradual changes on the mortality of L.vannamei infected with WSSV

(2)鹽度漸變對凡納濱對蝦攜帶WSSV情況的影響

不同鹽度下的病蝦體內(nèi)攜帶病毒量隨時間推移而逐漸增多見表4,高鹽度32±1漸變組與起始鹽度23±1組在 6h、48h存在顯著差異(P<0.05);低鹽度14±1漸變組與起始鹽度 23±1組在 6h、48h、96h存在顯著差異(P<0.05);在整個實驗中鹽度漸變組對蝦體內(nèi)病毒增殖速度與起始鹽度組的差不多,但后期死亡率明顯比起始鹽度高。

表4 感染W(wǎng)SSV后鹽度漸變至相應(yīng)鹽度凡納濱對蝦攜帶白斑綜合癥病毒量的情況Tab.4 Effects of salinity gradual changes on white spot syndrome virus copy number in L.vannamei infected with WSSV

2.3 各處理組中不同時期死亡對蝦病毒含量檢測

表5中對死亡個體病毒定量檢測結(jié)果可知,每個處理組的初期死亡個體病毒含量都低于死亡高峰期和后期,在感染W(wǎng)SSV后鹽度突變處理組中,死亡初期的高鹽度32±1組與起始鹽度23±1組存在顯著差異(P<0.05),死亡高峰中低鹽度 14±1組與起始鹽度23±1組存在顯著差異(P<0.05),且起始鹽度 23±1組病毒含量明顯高于另外兩鹽度組病毒含量;死亡后期不存在差異性。在先感染 WSSV后鹽度漸變和先鹽度漸變后感染 WSSV處理組中的不同鹽度組在不同死亡時期死亡個體病毒含量不存在顯著性差異;在鹽度突變后感染 WSSV處理組中,死亡初期和死亡高峰期中的起始鹽度 23±1組與另外兩鹽度組中死亡個體的病毒含量都存在顯著差異(P<0.05)。

3 討論

葉建生等(2008)報道鹽度突變會引起對蝦體內(nèi)產(chǎn)生一系列應(yīng)激反應(yīng),在短時間內(nèi)調(diào)節(jié)血液滲透壓,如對蝦體內(nèi)的超氧陰離子產(chǎn)量隨著鹽度突變值增加而增加,血清中酚氧化酶活性隨著鹽度突變值增加活性升高越快,血清中 SOD活性隨著鹽度突變值增加而降低,血清蛋白含量隨著降低。Perazzolo等(2002)也報道在鹽度從34降低至22或13會引起圣保羅對蝦(Farfantepenaeus paulensis)體內(nèi)血淋巴中血細(xì)胞數(shù)量減少了 20%,而且抗菌活力也下降了。Sudha等(1998)已將 WSSV與印度對蝦(Penaeus indicus)和斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon)的關(guān)系簡單分為 3種類型:第1種為早期急性感染,對蝦感染癥狀為出現(xiàn)大面積紅體,機體組織高度感染 WSSV,將在 2—3d內(nèi)出現(xiàn)大面積死亡;第2種為急性或亞急性感染,對蝦組織感染程度為中度到高度之間,會在 7—10d內(nèi)出現(xiàn)高的死亡率,主要的臨床癥狀為被感染的對蝦甲殼有明顯的白斑;第3種類型為慢性感染(潛伏感染),組織僅被輕度感染,不會伴隨有白斑和紅體等癥狀,將在15—28d內(nèi)出現(xiàn)死亡。有研究認(rèn)為鹽度改變會引起對蝦體內(nèi)相關(guān)免疫指標(biāo)變化,特別是鹽度降低能引起對蝦血細(xì)胞數(shù)量明顯降低,導(dǎo)致酚氧化酶活性升高。血細(xì)胞計數(shù)作為對蝦免疫指標(biāo)的重要參數(shù)之一,是因為對蝦血細(xì)胞具有溶菌作用、凝集作用,而且能合成與免疫相關(guān)的許多酶類如溶菌酶、酸性磷酸酶、堿性磷酸酶、酚氧化酶等(Le Moullacet al,2000)。

表5 不同處理組死亡凡納濱對蝦個體WSSV定量檢測結(jié)果Tab.5 WSSV amounts in the dead L.vannamei of different management group

兩組鹽度突變實驗中都發(fā)現(xiàn)鹽度突變對健康凡納濱對蝦存活影響顯著,特別是低鹽度14±1突變組累積死亡率明顯高于另兩組(P<0.05),原因可能是鹽度突變幅度已超出部分體質(zhì)較弱對蝦的滲透調(diào)節(jié)能力。在先鹽度突變后感染 WSSV實驗發(fā)現(xiàn)各鹽度組對蝦的累積死亡率在前期較低;病毒檢測也發(fā)現(xiàn)前期對蝦體內(nèi)病毒含量維持在較低水平,未達到對蝦體內(nèi)病毒含量的瀕死臨界值,而且起始鹽度23±1組對蝦累積死亡率都顯著低于另外兩突變組(P<0.05),說明感染初期由起始鹽度23±1突變至 14±1和 32±1提高了對蝦對病原體的易感性;感染后期由起始鹽度23±1突變至14±1和32±1促使病毒在對蝦體內(nèi)迅速擴增,伴隨著對蝦大量死亡。說明鹽度突變造成對蝦體質(zhì)損傷,抗病力下降,為病毒的擴增提供了溫床。

對攜帶 WSSV的對蝦進行鹽度突變實驗結(jié)果可知低鹽度14±1突變組在12 h突然出現(xiàn)大量死亡,且與另外兩組存在顯著差異(P<0.05);鹽度 14±1組累計死亡率比鹽度32±1突變組高,此結(jié)果與Joseph等(2007)報道的鹽度突變改變中國對蝦血淋巴代謝和降低了對 WSSV免疫力的死亡結(jié)果相似。從病毒檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)12h后低鹽度14±1突變組對蝦體內(nèi)病毒含量是起始鹽度23±1組的400倍,高鹽度32±1突變組是其的 30倍,也說明了此時各組之間累積死亡率的差異性;至實驗后期病毒含量已經(jīng)高于簡旭鳳(2003)報道的對蝦感染W(wǎng)SSV死亡時攜帶病毒的數(shù)量1×105copy/g,促使對蝦大量死亡。綜上可知:鹽度未突變時,病毒在對蝦體內(nèi)處于潛伏感染期,未有大量死亡和明顯病癥出現(xiàn);鹽度突變后,對蝦出現(xiàn)大量死亡,期間伴隨著紅體,空胃、空腸、肝胰腺腫大等癥狀。鹽度突變引起對蝦與 WSSV之間的關(guān)系發(fā)生轉(zhuǎn)變,從潛伏感染轉(zhuǎn)為急性感染。

兩組鹽度漸變實驗中都發(fā)現(xiàn)鹽度漸變過程中對對蝦存活影響不顯著;將對蝦馴化至不同鹽度后感染W(wǎng)SSV實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)0—24h各鹽度組對蝦累積死亡率無明顯差異,而且 0—12h內(nèi)檢測到對蝦體內(nèi)的病毒含量有下降趨勢,到 24h時病毒含量開始升高,但是病毒含量明顯低于簡旭鳳(2003)報道對蝦感染W(wǎng)SSV粗提液后死亡時攜帶病毒的數(shù)量超過 1×105copy/g,所以未見大量對蝦死亡;48h至實驗結(jié)束鹽度14±1組累積死亡率與其它組存在顯著差異(P<0.05),且高于其它組的累積死亡率,這與李才文等(2002)研究不同鹽度條件下感染 WSSV日本對蝦累積死亡結(jié)果相似。48h后病毒在對蝦體內(nèi)出現(xiàn)增殖高峰期,此后對蝦體內(nèi)病毒含量為(3.6×105)—(1.01×107)copy/g,這與孫成波等(2009)研究的斑節(jié)對蝦在高位池養(yǎng)殖過程中體內(nèi)病毒含量(9.5×105copy/g)相似,表明隨著病毒含量升高,對機體造成嚴(yán)重?fù)p傷,最終導(dǎo)致對蝦出現(xiàn)大量死亡。

先感染W(wǎng)SSV后鹽度漸變實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)0—24h起始鹽度 23±1組與另外兩鹽度漸變組存在顯著性差異,在 24h時感染組的累計死亡率都低于 18.9%,未出現(xiàn)大量死亡,而且 0—12h內(nèi)對蝦體內(nèi)病毒含量較低,但累積死亡率存在差異,可能是個別對蝦感染W(wǎng)SSV后對蝦機體已有損傷,外界環(huán)境稍有變化,即出現(xiàn)個別死亡。48h時兩鹽度漸變組對蝦出現(xiàn)死亡高峰,起始鹽度23±1組死亡率有升高,到96h達到最大值78.9%。產(chǎn)生這樣的結(jié)果可能是對蝦長期處于連續(xù)較大的鹽度漸變,導(dǎo)致對蝦必須長時間進行鹽度適應(yīng)調(diào)節(jié)降低了自身免疫能力,使 WSSV在體內(nèi)復(fù)制累積,當(dāng)累積到一定值時出現(xiàn)大量死亡。不管鹽度怎么變化,都會影響到對蝦與WSSV之間的關(guān)系,在未感染 WSSV時,鹽度突變和漸變都會提高對蝦對WSSV的易感性,在感染W(wǎng)SSV后,鹽度變化可能引起對蝦與 WSSV之間的關(guān)系發(fā)生轉(zhuǎn)變,從潛伏感染轉(zhuǎn)為急性感染,因此鹽度是引起白斑綜合癥暴發(fā)的關(guān)鍵影響因子。

葉建生,王興強,馬 甡等,2008.鹽度突變對凡納濱對蝦非特異性免疫因子的影響.海洋水產(chǎn)研究,29(1):38—43

孫成波,李 婷,王 平等,2009.高位池養(yǎng)殖對蝦攜帶白斑綜合癥病毒變化.海洋通報,28(2):116—120

孫成波,何建國,黎子蘭等,2006.凡納濱對蝦和斑節(jié)對蝦對WSSV敏感性的比較.湛江海洋大學(xué)學(xué)報,26(3):17—20

李才文,管越強,俞志明,2002.鹽度變化對日本對蝦暴發(fā)白斑綜合癥病毒病的影響.海洋環(huán)境科學(xué),21(4):6—9

吳信忠,2005.中國海洋病害主流研究的進展.太平洋學(xué)報,10:49—59.

何建國,莫 福,1999.對蝦白斑綜合癥病毒暴發(fā)流行與傳播途徑,氣候和水體理化因子的關(guān)系及其控制.中國水產(chǎn),(007):34—37

徐麗美,楊 豐,2001.利用定量PCR方法研究對蝦白斑桿狀病毒感染與發(fā)病的關(guān)系.高技術(shù)通訊,11(12):9—11

程曉燕,劉慶慧,黃 倢,2010.實時熒光定量PCR檢測對蝦白斑綜合癥病毒方法的建立.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),(26):14265—14267

簡旭鳳,2003.白斑綜合癥病毒(WSSV)原位PCR及定量PCR檢測技術(shù)的建立.廣州:中山大學(xué)碩士學(xué)位論文,1—67

Du H H,Li W F,Xu Z Ret al,2006.Effect of hyperthermia on the replication of white spot syndrome virus inProcambarus clarkii.Diseases of Aquatic Organisms,71(2):175—178

Flegel T W,Lio-Po G,2009.Current status of viral diseases in Asian shrimp aquaculture. Israeli Journal of Aquaculture-Bamidgeh,61(3):229—239

Granja C B,Vidal O M,Parra Get al,2006.Hyperthermia reduces viral load of white spot syndrome virus inPenaeus vannamei.Diseases of Aquatic Organisms,68(2):175—180

Gunalan B,Soundarapandian P,Dinakaran G K,2010.The effect of temperature and pH on WSSV infection in cultured marine shrimpPenaeus monodon(Fabricius).Middle East J Sci Res,5(1):28—33

Jiravanichpaisal P,S?derh?ll K,S?derh?ll I,2004.Effect of water temperature on the immune response and infectivity pattern of white spot syndrome virus(WSSV)in freshwater crayfish.Fish &Shellfish Immunology,17(3):265—275

Joseph A,Philip R,2007.Acute salinity stress alters the haemolymph metabolic profile ofPenaeus monodonand reduces immunocompetence to white spot syndrome virus infection.Aquaculture,272(1):87—97

Le Moullac G,Haffner P,2000.Environmental factors affecting immune responses in Crustacea.Aquaculture,191(1):121—131

Liu B,Yu Z,Song Xet al,2006.The effect of acute salinity change on white spot syndrome(WSS)outbreaks inFenneropenaeus chinensis.Aquaculture,253(1):163—170

Momoyana K,Nakano H,Koube H,1994.Mass mortalities of cultured Kuruma shrimp,Penaeus japonicus,in Japan in 1993:epizootiological survey and infection trials.Fish Pathology,29(2):135—139

Perazzolo L M,Gargioni R,Ogliari Pet al,2002.Evaluation of some hemato-immunological parameters in the shrimpFarfantepenaeus paulensissubmitted to environmental and physiological stress.Aquaculture,214(1):19—33

Sudha P M,Mohan C V,Shankar K Met al,1998.Relationship between white spot syndrome virus infection and clinical manifestation in Indian cultured penaeid shrimp.Aquaculture,167(1):95—101

Sun Y,Li F,Xiang J,2013.Analysis on the dynamic changes of the amount of WSSV in Chinese shrimpFenneropenaeus chinensisduring infection.Aquaculture,376:124—132

Tapay L M,Nadala Jr E C B,Loh P C,1999.A polymerase chain reaction protocol for the detection of various geographical isolates of white spot virus.Journal of Virological Methods,82(1):39—43

You X,Su Y,Mao Yet al,2010.Effect of high water temperature on mortality,immune response and viral replication of WSSV-infectedMarsupenaeus japonicusjuveniles and adults.Aquaculture,305(1):133—137