豬背最長肌PFK-2/F BPase-2熒光定量RT-PCR方法的建立

李朋穎，湯曉艷*，王 敏，康大成，顏成英

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

豬背最長肌PFK-2/F BPase-2熒光定量RT-PCR方法的建立

李朋穎，湯曉艷*，王 敏，康大成，顏成英

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

為研究糖酵解關(guān)鍵酶果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase，PFK-2/FBPase-2）基因轉(zhuǎn)錄水平與宰后肉品質(zhì)間的關(guān)系，根據(jù)豬PFK-2/FBPase-2 mRNA序列（GenBank登錄號：NM_001143721.1）設(shè)計一對特異性引物并選擇β-actin作為內(nèi)參基因，構(gòu)建含有各自序列的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了熒光定量實時-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測豬PFK-2/FBPase-2基因轉(zhuǎn)錄水平的方法。結(jié)果表明，所建立的方法線性關(guān)系好，目的基因與 內(nèi)參基因R2均大于0.999；靈敏度高，兩基因檢出下限均為10拷貝/μL；特異性好，擴(kuò)增產(chǎn)物均有特異性單一峰。同時根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可知目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率分別為104.5%和104.0%，擴(kuò)增效率接近一致，可對PFK-2/FBPase-2轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對定量。本研究選取PSE肉產(chǎn)生程度不同的三元雜交豬、杜洛克豬和太湖豬，利用建立的方法對不同品種豬宰后45 min背最長肌中PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，結(jié)果表明，太湖豬轉(zhuǎn)錄水平最高、杜洛克次之、三元雜交豬最低，且3 個品種間有顯著性差異（P＜0.05）。

豬；PFK-2/FBPase-2 mRNA；SyBR Green I；熒光定量實時-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

生豬屠宰后，肌肉組織經(jīng)過一系列變化過程轉(zhuǎn)化成肉，肌肉pH值從7.0降至5.5左右，肌肉首先變硬變粗，隨后變嫩，最終形成具有一定色澤、質(zhì)地、風(fēng)味等品質(zhì)特性的食用肉。研究表明，不同品種豬宰后其肉品質(zhì)具有一定差異性，同時宰前處理方式也會對最終肉品質(zhì)造成影響[1]，若品種選擇或宰前處理不當(dāng)則會產(chǎn)生劣質(zhì)肉，如發(fā)白、柔軟、多汁性（pale, soft, exudative，PSE）肉。每年由于PSE肉的產(chǎn)生給畜禽產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已經(jīng)知道，宰后無氧糖酵解速度和程度對肉品質(zhì)形成具有重要影響，無氧糖酵解速度越快，越易產(chǎn)生PSE肉[2]。研究表明，果糖-2,6-磷酸是糖酵解關(guān)鍵酶 磷酸果糖激酶（phosphofructokinase-1，PFK-1）的強(qiáng)力激活因子，其含量水平的升高可促進(jìn)糖酵解的進(jìn)行[3-4]，同時果糖-2,6-二磷酸的合成與分解受果糖-6-磷酸-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酯酶（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase，PFK-2/FBPase-2）的調(diào)節(jié)，因此PFK-2/ FBPase-2是影響能量代謝的關(guān)鍵調(diào)控酶，同時也是一個具有激酶和酯酶催化活性的雙功能酶[5-7]。

PFK-2/FBPase-2最早發(fā)現(xiàn)于大鼠肝臟，其可通過調(diào)節(jié)果糖-2,6-二磷酸含量來調(diào)節(jié)細(xì)胞中葡萄糖平衡，接著在哺乳動物心臟、睪丸、大腦、肌肉等組織中也有發(fā)現(xiàn)，且分子質(zhì)量及生物活性均存在差別[8]。目前對于PFK-2/FBPase-2的研究主要集中在腫瘤方面，研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比在腫瘤細(xì)胞中PFK-2/FBPase-2有較高水平的表達(dá)，且有報道稱在動物實驗中通過抑制PFK-2的表達(dá)可以減少腫瘤細(xì)胞的生長[9-11]，然而對于PFK-2/ FBPase-2在豬宰后糖酵解過程及在肉品學(xué)中的相關(guān)研究均未見報道。由于熒光定量實時-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction，RT-PCR）與普通PCR相比具有高特異性和高靈敏度，可實現(xiàn)模板的準(zhǔn)確定量的特點[12]，且已有人利用該方法對糖酵解有促進(jìn)作用的PRKAG3基因（編碼一磷酸腺苷激活蛋白激酶γ3亞基）與胴體品質(zhì)關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明PRKAG3在豬組織器官中的表達(dá)與胴體品質(zhì)具有相關(guān)性[13]，故本研究采用SyBR Green I熒光定量RT-PCR方法，以β-actin作為內(nèi)參基因，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測豬PFK-2/FBPase-2轉(zhuǎn)錄水平的方法，為進(jìn)一步研究PFK-2/FBPase-2與宰后豬肉品質(zhì)的關(guān)系提供方法和技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

取宰后45 min的6月齡太湖豬、杜洛克豬及三元雜交豬（杜洛克豬×（長白豬×大白豬））背最長肌各約100 mg，置于組織保存液中保存，送至實驗室于-20 ℃保存。取宰后45 min太湖豬背最長肌樣品用于建立SyBR Green Ⅰ熒光定量RT- PCR方法。

1.2 試劑與儀器

感受態(tài)菌株E.coli JM109、pMD18-T Vector、SyBR Premix Ex Taq Ⅱ、100 bp DNA Ladder Marker 寶生物工程（大連）有限公司；Trizol Reagent、SuperScript VILO cDNA合成試劑盒 美國Invitrogen公司；Universal DNA 純化回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒北京天根生化科技有限公司；RQ1 RNase-Free Dnase（Promega公司）；2×Power Taq PCR Master Mi x 百泰克生物技術(shù)有限公司。

EDC-810 PCR擴(kuò)增儀 東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；7500實時熒光定量PCR儀 美國Thermo Scientif i c公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中登錄的豬PFK-2/FBPase-2 mRNA序列，應(yīng)用Primer Premier 5.00軟件設(shè)計一對特異性引物，見表1。β-actin引物序列參考李龍等[14]，其中β-actin引物除進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)外，還可用于PCR鑒定逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA的質(zhì)量。PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 實時熒光PCR引物Table 1 Primers of real-time PCR

1.3.2 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄

將保存于組織保存液中的宰后45 min背最長肌樣本液氮研磨后，采用Trizol法提取總RNA，采用RNase-Free DNase消除DNA污染[15]。提取完成后，約1 μg的總RNA用于cDNA第1鏈的合成，按SuperScript VILO cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行，反應(yīng)條件為：25 ℃退火10 min，42 ℃延伸60 min，85 ℃再延伸5 min。反應(yīng)完成后測定產(chǎn)物濃度，將其質(zhì)量濃度稀釋至約40 ng/μL后，-20 ℃分裝保存。

1.3.3 cDNA第一鏈質(zhì)量檢測

采用內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行PCR反應(yīng)檢測cDNA質(zhì)量，25 μL反應(yīng)體系如下：2×Power Taq PCR Master Mix 12.5 μL，稀釋后模板cDNA 1.5 μL，β-actin上游引物1.5 μL，下游引物1.5 μL，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）處理水8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28 個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察。

1.3.4 PFK-2/FBPase-2及β-actin質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建

以1.3.2節(jié)獲得的cDNA為模板，分別擴(kuò)增PFK-2/ FBPase-2基因與β-actin基因的目的片段，反應(yīng)條件見1.3.5節(jié)。PCR產(chǎn)物經(jīng)Universal DNA純化回收試劑盒純化后克隆至pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌株E.coli JM109，應(yīng)用α互補(bǔ)法和氨芐青霉素篩選法篩選陽性轉(zhuǎn)化菌株，并通過PCR反應(yīng)及序列分析進(jìn)行驗證。提取質(zhì)粒后測定DNA濃度，以10 倍系列梯度稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品至濃度梯度為10 拷貝/μL。

1.3.5 反應(yīng)體系的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

熒光定量P C R總反應(yīng)體系2 0 μ L：S Y B R Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，10 μmol/L的上、下游引物設(shè)計3 個不同終濃度0.2、0.4 μmol/和0.8 μmol/L（相應(yīng)的添加體積為0.4、0.8 μL及1.6 μL），ROX Reference Dye 0.4 μL，質(zhì)粒模板 2 μL，ddH2O補(bǔ)足至終體積 20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火，設(shè)計不同退火時間（34、47、60 s），40 個循環(huán)，經(jīng)熒光定量PCR儀檢測后，以各稀釋濃度質(zhì)粒下對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)，以質(zhì)粒濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 特異性及靈敏度分析

通過儀器自帶熔解曲線程序分析熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定該方法的靈敏度。

1.3.7 不同品種豬宰后45 min PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測定

取宰后45 min的太湖豬、杜洛克豬及三元雜交豬背最長肌樣品提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后采用上述熒光PCR反應(yīng)體系及條件測定不同品種豬PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA第1鏈檢測

圖1 內(nèi)參基因β-aaccttiinn PCR電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of the housekeeper gene β-actin

由圖1可知，各cDNA都有內(nèi)參基因β-actin條帶擴(kuò)增，表明cDNA質(zhì)量較好，可用于后續(xù)實驗。

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定

PCR檢驗陽性轉(zhuǎn)化菌株，經(jīng)電泳檢測后可見有約216 bp和180 bp大小的目的條帶（圖2），與預(yù)期相符，表明目的片段已連接至pMD18-T載體上。將PFK-2/ FBPase-2與β-actin重組質(zhì)粒測序結(jié)果與GenBank上的序列進(jìn)行比對，其核苷酸序列完全一致（圖3、4）。表明已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒并保持序列的完整性。

圖2 2PFK-2/FBPase-2ase-2與β--actinactin mRNA部分片段PCR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 PCR amplification electrophoretogram of PFK-2/FBPase-2 and partial fragments of β-actin mRNA

圖3 3PFK-2/FBPase-2ase-2基因測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results of PFK-2/FBPase-2

圖4 4β-actinactin基因測序結(jié)果Fig.4 Squencing results of β-actin

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對SYBR Green I 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后可知，當(dāng)采用引物終濃度為0.2 μmol/L，退火時間為47 s時，反應(yīng)的特異性及線性擴(kuò)增范圍較好。在該反應(yīng)條件下建立PFK-2/FBPase-2與β-actin mRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)反應(yīng)體系中含1×101～1×107拷貝的豬PFK-2/FBPase-2基因片段時，擴(kuò)增反應(yīng)Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)值呈線性關(guān)系，線性方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=-3.216X+29.716，r=0.999 7。β-actin的線性方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=-3.231X+34.557，r=0.999 7。其中：Y為循環(huán)閾值；X為質(zhì)粒模板拷貝數(shù)的對數(shù)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到目的基因PFK-2/FBPase-2的擴(kuò)增效率為104.5%，同理根據(jù)內(nèi)參基因β-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線計算可得擴(kuò)增效率為104.0%。

2.4 PFK-2/FBPase-2及β-actin基因熒光PCR特異性結(jié)果

通過熔解曲線（圖5）分析表明，PFK-2/FBPase-2及β-actin基因均為特異性單峰，說明各基因熒光PCR產(chǎn)物為單一產(chǎn)物，特異性強(qiáng)。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，PFK-2/ FBPase-2及β-actin檢測下限均為10拷貝/μL。

圖5 5PFK-2PFK-2/FBPase-2ase-2（A）及A β-actinactin（B）基因熔解曲線圖Fig.5 Melting curves of swine PFK-2/FBPase-2 (A) and β-actin (B)

2.5 重復(fù)性實驗結(jié)果

圖6 樣品中PFK-2/FBPase-2（A）及β-actinactin（B）的3次重復(fù)檢測結(jié)果Fig.6 Results of three replicate detections of pig PFK-2/FBPase-2 (A) and β-actin (B)

對于不同的模板濃度，3 個平行樣品之間的Ct值差異不顯著，說明該方法有很好的重復(fù)性（圖6），圖中從左到右濃度數(shù)量級依次為107～101。

2.6 不同品種豬宰后PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測定

采用建立的相對熒光定量PCR方法對太湖豬、杜洛克豬及三元雜交豬（杜洛克豬×（長白豬×大白豬））宰后45 min背最長肌PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。由圖7可知，宰后45 min時，太湖豬背最長肌PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平最高、杜洛克次之、三元雜交豬最低，且3 個品種間具有顯著性差異（P＜0.05），因此可認(rèn)為在宰后初期45 min內(nèi)，肌肉能量代謝水平具有差異性。

圖7 不同品種豬宰后PFK-2/FBPase-2 mRNA相對表達(dá)量Fig.7 Relative transcription levels of PFK-2/FBPase-2 mRNA of different breeds postmortem

3 討 論

熒光定量RT-PCR具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點，是分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中常用的檢測手段。本研究采用SyBR Green I熒光染料法建立豬背最長肌PFK-2/ FBPase-2 mRNA RT-PCR相對熒光定量檢測方法，實驗結(jié)果表明，在引物終濃度為0.2 μmol/L，退火時間為47 s時，可滿足特異性與高擴(kuò)增效率的要求。因此在最佳反應(yīng)條件下，目的基因與內(nèi)參基因反應(yīng)的特異性及線性擴(kuò)增范圍較好，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均大于0.999；靈敏度較高，可檢測低于100 拷貝/μL；反應(yīng)特異性強(qiáng)，熔解曲線只有特異性單峰，且瓊脂糖電泳僅有一條特異性條帶。此外，根據(jù)優(yōu)化條件下標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計算得到的2基因的擴(kuò)增效率較為一致且接近于1。由于本研究在定量方法上選擇比較Ct法進(jìn)行相對定量，因此在進(jìn)行定量計算時，需保證目的基因與內(nèi)參基因具有較一致的擴(kuò)增效率，且兩者擴(kuò)增效率應(yīng)接近于1，故本實驗結(jié)果符合此要求。綜上實驗結(jié)果可知，本研究建立的方法可利用β-actin作內(nèi)參進(jìn)行相對定量，消除樣品采集和RNA反轉(zhuǎn)錄操作過程中的誤差對樣品定量結(jié)果的影響，定量結(jié)果可靠[16]。

熒光定量RT-PCR方法已經(jīng)在肉類研究中得到大量應(yīng)用，Sieczkowska等[17]利用熒光RT-PCR方法測定3 種豬品種丙酮酸激酶（pyruvate kinase-2，PKM2）基因表達(dá)量，并研究其與糖酵解潛能和肉品質(zhì)的關(guān)系，研究發(fā)現(xiàn)PKM2基因表達(dá)量的增加與糖酵解潛能、乳酸含量、pH值和滴水損失關(guān)系密切。此外PRKAG3作為編碼AMPKγ3亞基的基因，其表達(dá)可促進(jìn)糖酵解過程的進(jìn)行[18]，采用熒光定量RT-PCR方法對PRKAG3與肉品質(zhì)關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同品種豬骨骼肌中PRKAG3基因表達(dá)量有差異且其表達(dá)量與肌內(nèi)脂肪含量呈正相關(guān)[13]。

大量研究證實，國內(nèi)地方品種豬在肉品質(zhì)方面較國外品種具有一定優(yōu)勢，PSE肉發(fā)生率較低[19-21]。因此本研究選擇本地品種豬太湖，國外品種豬杜洛克及三元雜交豬的背最長肌作為樣品，采用建立的方法對不同品種豬宰后45 min PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行測定，結(jié)果表明，太湖豬背最長肌PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平最高、杜洛克次之、三元雜交豬最低，且3 個品種間具有顯著性差異（P＜0.05）。PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平有差異，表明3 個品種豬代謝水平具有差異性，而代謝水平與肉品質(zhì)相關(guān)[22]。本研究中所選取的豬品種中，太湖豬肉品質(zhì)最好，且PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平最高，說明肉品質(zhì)與PFK-2/FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有一定相關(guān)性。以后可以將此方法運(yùn)用于研究PFK-2/FBPase-2在正常肉與PSE肉中的轉(zhuǎn)錄水平，從而進(jìn)一步研究PFK-2/FBPase-2與PSE肉的相關(guān)性。

4 結(jié) 論

本研究通過優(yōu)化實驗條件建立了相對熒光定量RTPCR技術(shù)檢測豬PFK-2/FBPase-2基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，結(jié)果表明所建立的方法線性關(guān)系好、靈敏度高、特異性強(qiáng)，目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致，可對PFK-2/ FBPase-2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行相對定量，對研究PFK-2/ FBPase-2與肉品質(zhì)關(guān)系及其在PSE肉中的作用提供技術(shù)參考。

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Development of RT-PCR Assay for PFK-2/FBPase-2 in Swine longissimus dorsi Muscle

LI Peng-ying, TANG Xiao-yan*, WANG Min, KANG Da-cheng, YAN Cheng-ying
(Key Laboratory of Agro-Food Safety and Quality, Ministry of Agriculture, Institute of Quality Standards and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China)

In order to explore the relationship between P FK-2/FBPase-2 mRNA transcription level and postmortem meat quality, a pair of primers was designed and β-actin was chosen as housekeeper gene in this study according to swine PFK-2/FBPase-2 mRNA sequences available in GenBank (NM_001143721.1). Under the optimal experimental conditions, a real-time fl uorescent quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay wa s established to d etect swine PFK-2/FBPase-2 gene. The results showed that both the correlation coeff i cient (R2) of the standard curves of PFK-2/FBPase-2 and the housekeeper gene β-actin were more than 0.999, the sensitivity was high and detection limits of the two genes were 10 copies/μL. In addition, the specif i city was high and the amplif i cation products were specif i cally single peaks. Meanwhile the amplif i cation eff i ciency of PFK-2/FBPase-2 (104.5%) was consistent with that of β-actin (104.0%). According to the extent of PSE meat production, the longissimus dorsi muscles of Taihu, Duroc and Duroc× (Landrace × yorkshire) were selected to measure the transcription level of PFK-2/FBPase-2 mRNA at 45 min in different breeds by the established method. The results showed that Taihu had the highest PFK-2/FBPase-2 mRNA transcript level, followed by Duroc, the lowest was Duroc × (Landrace × yorkshire), and there was signif i cant difference among these three breeds (P ＜ 0.05).

swine; PFK-2/FBPase-2 mRNA; SyBR Green I; real time-polymerase chain reaction (RT-PCR)

TS251.1

A

1002-6630（2014）14-0113-05

10.7506/spkx1002-6630-201414022

2014-03-24

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（31000799）；“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAD28B03）

李朋穎（1989—），女，碩士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全。E-mail：xiaomianhu0725@126.com

*通信作者：湯曉艷（1976—），女，研究員，博士，研究方向為畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全標(biāo)準(zhǔn)與檢測。E-mail：txycaas@126.com