郝學(xué)財，劉 娜，鄧 莉，呂 麗，郭 聰

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司研發(fā)中心，天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點實驗室，天津 300300）

基于儀器分析與調(diào)香技術(shù)的香精解析及模擬

郝學(xué)財，劉 娜，鄧 莉，呂 麗，郭 聰

（天津春發(fā)生物科技集團(tuán)有限公司研發(fā)中心，天津市風(fēng)味食品配料企業(yè)重點實驗室，天津 300300）

采用頂空固相微萃取法提取香精的香氣成分，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行成分分析，運用香味萃取稀釋分析確定關(guān)鍵香氣活性物質(zhì)，并使用外標(biāo)法定量還原其組成。而后通過調(diào)香手段進(jìn)行修飾，以儀器分析和感官評價結(jié)果為指標(biāo)，通過不斷修訂配方得到相似度較好的試配香精，得到了儀器分析技術(shù)輔助香精調(diào)配的現(xiàn)代操作模式。

儀器分析；調(diào)香；香精；關(guān)鍵香氣化合物；香氣模擬

隨著咸味香精行業(yè)的迅速發(fā)展，其使用越來越廣泛，因此要求企業(yè)具備一定的香精解析、模擬及創(chuàng)新實力，進(jìn)而開發(fā)出具市場價值的產(chǎn)品。

調(diào)香師作為香精的設(shè)計者，必須對于香精的配方設(shè)計做出最科學(xué)和最具創(chuàng)意的方案。早期的調(diào)香基本上是以經(jīng)驗型為主，隨著現(xiàn)代分析技術(shù)的發(fā)展，逐步出現(xiàn)了以儀器的分析數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)進(jìn)行再加工，同時結(jié)合調(diào)香師豐富的經(jīng)驗的調(diào)香工作方法，這使得調(diào)香過程更加有的放矢，大大提高了工作效率。

在香氣研究中，氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用技術(shù)無疑是這么多年來的首選，自從這2 種儀器的首次成功結(jié)合，GC-MS在香氣分析中就一直發(fā)揮著巨大的作用[1]。樣品前處理的方法很多，其中固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）是20世紀(jì)90年代發(fā)展起來的一種高效的樣品預(yù)處理技術(shù)[2-5]。該技術(shù)集采樣、濃縮于一體，無需溶劑、操作簡單、靈敏度高、非常適合香氣成分的快速分析[6-13]。但是GC-MS不能對香精中賦予風(fēng)味特征的關(guān)鍵化合物進(jìn)行定性，無法確定各種香氣化合物對總體香氣貢獻(xiàn)的大小。氣相色譜-嗅聞-質(zhì)譜（gas chromatography-olfactory-mass spectrometry，GCO-MS）技術(shù)能有效解決這些問題，它將GC的分離能力與人類鼻子敏感的嗅覺聯(lián)系在一起，將經(jīng)過前處理的樣品注入到在檢測器端連有聞香儀的色譜柱中，香氣組分首先通過GC進(jìn)行分離，再從聞香儀出口逐一流出，由聞香人員加以判斷、確定物質(zhì)種類[14-19]，同時，結(jié)合MS強大的定性能力，這種方式對鑒別特征香氣化合物、香氣活性化合物及用來確定各組分的香氣強度及貢獻(xiàn)很有價值，是用來研究香氣的有力工具，是目前最為完善的人工感官檢測技術(shù)。香味萃取稀釋分析（aroma extract dilution analysis，AEDA）[20-22]是指在復(fù)雜的混合物中，對其中香味成分用稀釋的方法來測定它的相對香氣濃度，AEDA中把一個化合物能聞到的最高稀釋度作為它的香氣稀釋（flavor dilution factor，F(xiàn)D）值，根據(jù)FD值大小測定各香味活性化合物對香精整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)大小。

本研究采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro extraction，HS-SPME）提取香精的香氣成分，利用GC-MS對香氣成分進(jìn)行分離、鑒定，結(jié)合GC-O-MS和AEDA找到表征其特征香味的關(guān)鍵化合物[23-24]，并通過外標(biāo)法測定FD值較高的化合物具體含量，對香精進(jìn)行初步解析。在此基礎(chǔ)上通過調(diào)香手段進(jìn)行模擬，以儀器分析和感官評價為依據(jù)，得到相似度較高的試配香精。該法為香精的模擬和創(chuàng)造提供了一種較為科學(xué)的方法，是一種將儀器分析技術(shù)和調(diào)香技術(shù)相結(jié)合的現(xiàn)代調(diào)香模式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-巰基-3-丁醇、3-甲硫基丙醛、2,3-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醇、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙?；拎骸⑦秽?、2,3,4,5-四甲基吡嗪、乙基麥芽酚、雙（2-甲基-3-呋喃基）二硫醚、植物油、N-丙基乙二胺（N-propylethy lendiamine，PSA）、無水硫酸鎂（650 ℃烘4 h） 石家莊利達(dá)化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

6890-5975型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀 美國Agilent公司；石英毛細(xì)管色譜柱HP-5MS（60 m×0.25 mm，0.25 ?m）、聞香儀 瑞士Brechbuhler公司；Sniffer 9000系列SPME取裝置、手柄、50/30 ?m二乙烯苯/聚乙二醇/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維頭 美國Supelco公司；XS205型分析天平 美國Mettler Toledo公司；80-2B型離心機 上海精密儀器儀表公司；XW-80A渦旋振蕩器 上海精科科學(xué)儀器有限公司；MH-2800E型多用恒溫箱 天津奧特賽思儀器有限公司；10 mL玻璃具塞離心管 上海壘固儀器有限公司；0.2 μm微孔濾膜 天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 香精揮發(fā)性成分提取

稱取香精樣品0.2 g，加入到20 mL配有聚四氟乙烯膠墊的頂空瓶中。將SPME裝置穿過膠墊插入密封瓶中，推出萃取頭，室溫條件下頂空萃取40 min，取出萃取頭，立即插入GC進(jìn)樣口中，解吸2 min，進(jìn)樣分析。

1.3.2 儀器分析條件

GC色譜柱：HP-5MS彈性石英毛細(xì)管色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；載氣：高純（≥99.999%）氦氣；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持3.0 min，5 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，再以10 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

MS條件：電子電離源；電子能量：70 eV；電子倍增器電壓：1 654 V；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；接口溫度：260 ℃；掃描模式：全掃描；質(zhì)量掃描范圍：35～450 u；延遲時間：4 min。

樣品經(jīng)GC-MS分析，各分離組分鑒定由計算機在NIST 05譜庫中和公司自建原料庫檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖對照，得到定性結(jié)果，同時通過Agilent自帶的化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，用色譜峰面積歸一化法進(jìn)行相對定量。

1.3.3 單體香料分析和模擬香精樣品的配制

10 種單體原料分別用植物油稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%后，采用1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)行提取并分析。模擬香精樣品具體組成見表1。

表1 模擬香精樣品配方表Table 1 Componentsof mimic flavoring sample

1.3.4 嗅聞香氣及確定關(guān)鍵香氣成分

GC-O-MS：在氣相色譜柱末端安裝不銹鋼分流口，分流樣品（分流比1∶1）到MS檢測器和聞香儀。將用SPME法萃取到的香氣成分注入到在GC柱中，由聞香人員在聞香儀出口嗅聞所聞到的香味和強度，進(jìn)行物質(zhì)定性定量鑒定。

關(guān)鍵香味活性物質(zhì)鑒定：模擬香精樣品按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)行提取并分析，采用頂空吸附時間逐漸減半的方式，吸附時間40、20、10、5 min等按照2的倍數(shù)系列稀釋后進(jìn)行GC-O-MS分析，直到嗅聞人員不再聞到氣味則停止稀釋，每種香味化合物的最高稀釋倍數(shù)為其FD因子。選擇FD因子最高的2 種化合物，作為關(guān)鍵香味活性物質(zhì)采用外標(biāo)法進(jìn)行精確的數(shù)值測定。

1.3.5 模擬香精樣品的試配

調(diào)香師根據(jù)感官聞香和GC-MS分析結(jié)果，結(jié)合經(jīng)驗初擬配方，對模擬香精樣品與試配香精進(jìn)行GC-MS香氣分析（采用1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)行提取并分析）和感官評價尋找差異從而修訂配方。

1.3.6 感官評價

由6 人組成評香小組，以模擬香精樣品的香氣為滿分10 分，對試配樣品進(jìn)行感官評定，給出相似度評分，以平均值作為試配樣品的整體香氣相似度結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 模擬香精樣品成分初步解析

2.1.1 GC-MS解析

模擬香精樣品按照1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法進(jìn)行提取并分析，總離子流圖見圖1，與NIST 05譜庫和自建單體庫對照，對各個組分進(jìn)行初步定性分析，鑒定出各自的成分及相對含量解析結(jié)果見表2。

圖1 模擬香精樣品揮發(fā)性成分總離子流圖Fig.1 Total ion current (TIC) chromatogram of volatile components in mimic flavoring sample

表2 模擬香精樣品揮發(fā)性成分及相對含量Table 2 Votatile compounds of mimic flavoring sample

從表2可以看出，模擬香精樣品中的目標(biāo)成分通過HS-SPME和GC-MS分析全部檢測出來。

2.1.2 GC-O-MS解析和香味稀釋分析

10 種單體原料分別用植物油稀釋到質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%后，采用1.3.1節(jié)和1.3.2節(jié)方法對3 位聞香人員進(jìn)行培訓(xùn)后，以模擬香精樣品進(jìn)行實驗，聞香人員在聞香儀出口記錄聞到的氣味時間、香味特征和香氣強度，按照關(guān)鍵香味活性物質(zhì)鑒定方法進(jìn)行關(guān)鍵香味活性物質(zhì)鑒定，3 位嗅聞人員描述一致方可確定活性化合物。

表3 模擬香精樣品中香味活性化合物定性定量結(jié)果及FD因子值Table 3 Qualitaton and FD of aroma compounds in mimic flavoring samples

從表3可以看出，除了4-羥基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮之外，其他化合物稀釋后均可嗅聞到，其中3-甲硫基-丙醛和2,3-二甲基吡嗪的FD因子值最高，均為32，為模擬香精樣品中的關(guān)鍵香味活性化合物。

2.1.3 關(guān)鍵香味活性化合物定量分析

標(biāo)準(zhǔn)品系列配制：以3-甲硫基丙醛和2,3-二甲基吡嗪作為標(biāo)樣，以色拉油為基質(zhì)，配制0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mg/g和5.0 mg/g共7 個不同水平混標(biāo)物，進(jìn)行提取。

提取方法：稱取0.2 g混標(biāo)物于10 mL玻璃具塞離心管中，加入1 mL乙醇，渦旋混合2 min，加入0.2 g PSA和0.2 g無水硫酸鎂，再次渦旋混合2 min，6 000 r/min離心5 min，取清液，0.2 ?m濾膜過濾后待分析。

工作曲線繪制：7 個不同水平混標(biāo)物經(jīng)提取后，進(jìn)行GC-MS分析，進(jìn)樣量0.2 ?L，分流比100∶1。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，水平為橫坐標(biāo)，繪制出工作曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 關(guān)鍵香味物質(zhì)峰面積與質(zhì)量濃度關(guān)系工作曲線Fig.2 Relationships between peak areas of key aroma-active components and their concentrations

模擬香精樣品計算：模擬香精樣品經(jīng)提取分析后，按照工作曲線計算出2,3-二甲基吡嗪和3-甲硫基丙醛含量分別為0.218%和0.333%，誤差分別為6.44%和5.93%。

2.2 調(diào)香模擬

根據(jù)儀器數(shù)據(jù)解析結(jié)果，調(diào)香師結(jié)合感官嗅聞結(jié)果和經(jīng)驗對香精進(jìn)行模擬制備，得到試配香精。將模擬香精樣品和試配香精樣品進(jìn)行GC-MS差異識別和感官相似度評價，以此為依據(jù)修訂配方至與模擬香精香氣相似度較為接近的試配香精樣品為終樣，其配方見表4。二者配方較為接近，感官評價相似度結(jié)果為8.63，圖3的GC-MS分析數(shù)據(jù)顯示：模擬香精樣品和試配香精樣品色譜圖較為接近，模擬效果較好。

表4 香精最終配方Table 4 Components of mimic flavoring sample, tentative flavoring formuation and final flavoring formulation%

圖3 模擬香精樣品和試配樣品終樣的GC-MS分析結(jié)果Fig.3 GC-MS analytical results for mimic flavoring samples and final flavoring formulation

3 結(jié) 論

應(yīng)用HS-SPME-GC-MS和GC-O-MS對模擬香精樣品揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和鑒定。調(diào)香師在儀器分析數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，結(jié)合調(diào)香實踐經(jīng)驗，利用感官分析模擬香精。通過比較GC-MS分析結(jié)果和感官評價結(jié)果修訂配方，最終制備的試配樣品與模擬香精樣品香氣相似度達(dá)8.63成，效果較好。實現(xiàn)了儀器分析技術(shù)輔助香精調(diào)配的現(xiàn)代操作模式，提供了一種科學(xué)的方法。

[1] 汪正范. 色譜聯(lián)用技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2007.

[2] STEPHEN B S, DAVID L A. Solid phase microextraction of alkenylbenzenes and other flavorrelated compounds from tobacco for analysis by selected ion monitoring gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 1999, 85(8): 79-89.

[3] YANG S S, SMETENA I. Determination of tobacco alkaloids using solid phase microextraction and GC-NPD[J]. Chromatographia, 1998, 4(7): 443-448.

[4] PILLONEL L, BOSSET J O, TABACCHI R. Rapid pre-concentration and enrichment techniques for the analysis of food volatile: a review[J]. LWT-Food Science and Technology, 2002, 35(1): 1-14.

[5] 傅若農(nóng). 固相微萃取(SPME)的演變和現(xiàn)狀[J]. 化學(xué)試劑, 2008, 30(1): 13-22.

[6] YAN I J, ZHANG Y F, TAO W Y, et a1. Rapid determination of volatile flavor components in soy sauce using head space solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry[J]. Chinese Journal of Chromatography, 2008, 26(3): 285-291.

[7] 陳智毅, 劉學(xué)銘, 施英, 等. 頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用分析白金針菇中的揮發(fā)性成分[J]. 食用菌學(xué)報, 2009, 16(3): 73-75.

[8] SCHUREK J, PORTOLéS T, HAJSLOVA J, et al. Application of head-space solid-phase microextraction coupled to comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry for the determination of multiple pesticide residues in tea samples[J]. Analytica Chimica Acta, 2008, 611(2): 163-172.

[9] 劉春香, 何啟偉, 劉揚岷. 黃瓜香氣成分的頂空固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用分析[J]. 園藝學(xué)報, 2003, 28(3): 58l-583.

[10] FLóREZ M J C, FERN?NDEZ S M L, FERN?NDEZ M E, et a1. Static headspace versus head space solid-phase microextraetion (HS-SPME) for the determination of volatile organochlorine compounds in landfill leachates by gas chromatography[J]. Talanta, 2004, 63(4): 809-814.

[11] 郭方道, 黃蘭芳, 周邵云. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法用于白術(shù)中揮發(fā)性成分的分析[J]. 色譜, 2007, 25(1): 43-47.

[12] CHIAROTTI M, MARSILI R, MOREDA P A. Gas chromatographicmass spectrometric analysis of residual solvent trapped into illicit cocaine exhibits using head-space solid-phase microextraction[J]. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2002, 772(2): 249-256.

[13] 連宗衍, 楊豐慶, 李紹平. 頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法定性定量分析廣藿香中的揮發(fā)性成分[J]. 分析化學(xué), 2009, 37(2): 283-287.

[14] 宋國新, 余應(yīng)新, 王林祥, 等. 香氣分析技術(shù)與實例[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 33-44.

[15] FULLER G H, STELLENTEMP R, TISSERAND G. The gas chromatograph with humen sensor: perfume model[J]. New York Academy of Sciences, 1964, 116: 711-724.

[16] ACREE T E, BUTTES R M, NELSON P R, et a1. Sniffer to determine the odor of gas chromatographic effluents[J]. Analysis Chemistry, 1976, 48(12): 1821-1822.

[17] ACREE T E, BARNARD J, CUMMINGHAM D G. A procedure for the sensory analysis of gas chromatographic effluents[J]. Food Chemistry, 1984, 14(4): 273-286.

[18] ULRICH F, GROSCH W. Identification of the most intense volatile flavorcompounds formed during autoxidation of linoleic acid[J]. Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung, 1987, 184(4): 277-282.

[19] FRIEDICH J E, ACREE T E. Gas chromatography olfactometry (GC/O) of dairy products[J]. International Dairy Journal, 1998, 38(8): 235-241.

[20] GROSCH W. Evaluation of the key odorants of foods by dilution experiments, aroma models and omission[J]. Chemical Senses, 2001, 26(5): 533-545.

[21] 宋煥祿. 分子感官科學(xué)及其在食品感官品質(zhì)評價方面的應(yīng)用[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2011, 37(8): 126-130.

[22] 宋煥祿. 食品風(fēng)味分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 北京工商人學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 2006, 24(1): 1-4.

[23] GREGER V, SCHIEBERLE P. Characterization of key aroma compounds in apricots (Prunus armeniaca) by application of the molecular sensory science concept[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 5221-5228.

[24] STEINHUAS P, SCHIEBERLE P. Characterization of the key aroma compounds in soy sauce using approaches of molecular sensory science[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 6262-6269.

Analysis and Simulation of Volatile Components of Flavorings Based on Instrumental Analysis and Flavoring Technology

HAO Xue-cai, LIU Na, DENG Li, Lü Li, GUO Cong
(Food Ingredients Enterprise Key Laboratory of Tianjin, Tianjin Chunfa Bio-Technology Group Co. Ltd., R&D Center, Tianjin 300300, China)

The applicability of headspace solid-phase micro extraction (HS-SPME) combined with gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) and gas chromatography-olfactory-mass spectrometry (GC-O-MS) for the determination of aroma components of flavorings was investigated. The critical aroma components were identified by aroma extractiondilution analysis (AEDA) and imitated with an external standard method by GC-MS. Flavoring formulations were designed and modified by repeated comparisons of the results of instrumental analysis and sensory evaluation to establish the optimal formulation. This work will provide a theoretical basis for developing modern flavoring technology by instrumental analysis.

instrumental analysis; flavoring technology; flavor; key aroma-active components; aroma simulation

TS207.3

A

1002-6630（2014）24-0141-04

10.7506/spkx1002-6630-201424027

2014-10-10

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（863計劃）項目（2013AA102100）

郝學(xué)財（1981—），男，碩士，主要從事咸味食品香精研發(fā)。E-mail：haoxchao@126.com